Μελέτη του ενζύμου της RNA πολυμέρασης III σε δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που έχουν μολυνθεί από τον ιο του θηλώματος του ανθρώπου (HPV)

The etiologic correlation between cervical cancer and human papillomavirus (HPV) infection is well established. The high-risk HPV types, express the oncoproteins E6 and E7, which inactivate the tumor suppressor proteins TP53 and retinoblastoma (RB1) respectively. Thus, HPV overcomes the cell cycle control as well as apoptosis. Furthermore, the tumor suppressors TP53 and RB1 regulate directly the transcriptional activity of RNA polymerase III (RNA pol III). The changes in RNA pol III activity impact on the cellular biosynthetic capacity. The aim of the present study was the analysis of RNA pol III transcription in cervical cancer cells, infected by high-risk types of HPV, with respect to cell cycle control, cellular activation and commitment for mitosis during the G1/S phase transition. Thirty-five cervical cancer biopsies, 26 high (HSIL) and 33 low-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL), as well as 28 normal cervical samples, as controls, were used in this study. From these samples total DNA, RNA and proteins were extracted. All the samples were tested for the HPV DNA by PCR and HPV positive cases were further analyzed for HPV genotype. All the samples of the control group were found to be HPV DNA negative. Furthermore, the HPV integration status was also examined. The HPV integration leads to the abolishment of the viral E2 gene expression, which represses the E6 and E7 oncoprotein expression. Thus, HPV integration is accompanied by E6 and E7 upregulation when compared with the expression levels of episomal HPV cases. The transcriptional levels of RNA pol III and its regulation in high-risk HPV type positive cervical cancer cells were also examined. RT-PCR analysis was performed for primary transcripts of class III genes, that transcribed by RNA pol III, like tRNAs (tRNATyr, tRNAArg, tRNALeu), 5S rRNA, MRP RNA, a RNA molecule necessary for the replication of mitochondrial DNA and the splicing of large rRNAs, and 7SK RNA, which regulates a transcription elongation factor of RNA polymerase II. It was found that the expression levels of tRNAs and 5S rRNA were upregulated in cervical cancer biopsies compared to controls. In parallel, when HPV was integrated in the host genome the RNA pol III transcription was even stronger. The 7SK and MRP transcripts presented different profiles of expression possibly as result of the distinct promoters utilized for their transcription. Analysis of the transcriptional levels of the RNA pol III transcriptional factor TFIIIC2 subunits, TFIIICα, TFIIICβ, TFIIIC90, TFIIIC102 and TFIIIC63, revealed significant differences among samples. It seems that TFIIIC2 is not restricted factor for RNA pol III transcription in cervical cells and that HPV does not induce the expression of its subunits, while HPV integration does. Analysis of the expression levels of the RNA pol III transcription factor TFIIIB subunits, TBP, Brf1 and Bdp1, revealed that Brf1 expression correlates with disease, HPV presence and integration status, as well as RNA pol III transcription levels. The increased transcriptional levels of Brf1 do not correlate with TP53 and RB1 degradation by E6 and E7 respectively. These data suggest that Brf1 is restricted factor for RNA pol III transcription in uterine cervix. Because RNA pol III transcription is significantly elevated during the G1/S phase transition of the cell cycle, the response of Brf1 was examined in G1 and S phases in HeLa cells transfected with Brf1 after synchronization. It was found that Brf1 activates the transcription of tRNAs and 5S rRNA in G1 and 5S rRNA in S phase of the cell cycle. In conclusion, three complementary mechanisms may therefore allow high-risk HPV to stimulate production of tRNA and 5S rRNA: a) E6-mediated removal of p53; b) E7-mediated neutralization of RB; and c) induction of Brf1. The resultant increase in biosynthetic capacity may contribute to deregulated cell growth. For the further investigation of G1/S transition of the cell cycle in cervical cancer cells infected by high-risk HPV types, the expression levels of 24 genes were analyzed. The genes examined were major and regulatory genes of cell cycle such as cyclins (CCNs) and cyclin-dependent kinases (CDKs), CDKs inhibitors (CDKNs) of both families Cip/Kip and ΙΝΚ4, genes of the transcription factor family E2F, genes of the RB1 (pocket proteins) and TP53 families as well as genes, necessary for the S phase of the cell cycle, that regulated by E2F. Progression of the cell cycle from G1 to S phase depends on the presence of two holoenzymes, Cyclin D/Cdk4 or Cdk6, and Cyclin E/Cdk2. Regulation of this cell cycle checkpoint is based on the TP53 (TP53-MDM2-CDKN1A-CDKN2D) and RB1 (RB1-E2F-CCND1-CDK4-CDK6-CDKN2A) pathways. Inactivation of TP53 and pocket proteins, RB1, RBL1 and RBL2, by the viral oncoproteins of high-risk HPV types, E6 and E7, is a prerequisite for oncogenesis but is not sufficient to convert normal cells into an immortalized or malignant state. A number of secondary factors, are thought to influence the likelihood that a high-risk type HPV infection will persist and progress to cervical cancer, possibly though genetic and epigenetic alterations, activation of proto-oncogenes and loss of tumour suppressors as well as immunological responses. Squamous intraepithelial lesions (SIL) infected by high-risk HPV types and expressing E6 and E7 do not exhibit such a proliferative or invasive phenotype as tumours. Furthermore, cervical carcinoma develops infrequently even after infection with high-risk types of HPV, and it typically occurs years to decades after the initial infection. These observations suggest that other regulatory proteins of the G1/S checkpoint may act to compensate for aggressive growth. Five out of 24 genes tested, RBL2, E2F2, CDK6, CCNE1 and MYC, found to be upregulated in cervical cancer in 80%, 80%, 97%, 74% and 74% of cases respectively. Eight genes found to be upregulated in both cervical cancer and HSILs, E2F1 in 84% and 71%, E2F3 in 81% and 74%, E2F5 in 86% and 81%, CCND1 in 77% and 52%, CDK2 in 88% and 62%, CDKN1B in 86% and 77%, PCNA in 89% and 69%, as well as POLA in 62% and 52%. Only 5 out of 24 genes tested found to be in elevated levels in all three groups of cases, cervical cancer, HSIL and LSIL, when compared with controls, TP53 is elevated in 80% of tumours, 69% of HSILs and 64% of LSILs, E2F4 in 89%, 81% and 76%, CDKN1A in 82%, 73% and 70%, CDKN2A in 86%, 82% and 77% as well as DHFR in 75%, 70% and 62%, respectively. The MDM2 gene presents a unique profile with overexpression in 88% and 73% of HSILs and LSILs, respectively. The RBL1 found to be downregulated in 97%, 88% and 73% of tumours, HSILs and LSILs. TP73 presented lower levels in 60% of cervical cancers. However, TP73 isoforms containing exon 13 is significant increases in 73% and 69% of tumours and HSILs, while isoforms containing exon 2 found to be downregulated in 97% and 73% of tumours and HSILs respectively. Three genes, RB1, CDK4 and CDKN2D, did not exhibit any significant alteration in gene expression. Our data suggest that deregulation of G1/S phase transition in cervical carcinogenesis is a progressive process. Certain clusters of genes are activated very early in pre-cancerous SILs while others are activated later, during malignant transformation. The ability of this array of markers to identify disease status suggests that it could be used in clinical arena. Hierarchical clustering of gene expression was able to classify the cervical tissue samples according to disease status, with few discrepancies (6.6%). The examined genes were clustered in three groups of low, TP73 exon 2, RBL1 and TP73; moderate, POLA, CCND1, CDK2, E2F4, CDK6, MDM2, B2M, CDKN2D, MYC, CDKN1A, RBL2, E2F2, TP73 exon 13, CCNE1, and CDKN2A; and high, CDK4, E2F3, E2F5, E2F1, RB1 PCNA, CDKN1B, TP53 and DHFR, expression. These data suggests a possible diagnostic importance.Η αιτιολογική συσχέτιση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και της μόλυνσης από τον ιό του θηλώματος του ανθρώπου (human papillomavirus, HPV) είναι αδιαμφισβήτητη. Οι υψηλού κινδύνου τύποι του ιού HPV εκφράζουν τις ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7, που μπορούν να αδρανοποιούν τις ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες p53 (TP53) και ρετινοβλάστωμα (RB1) αντίστοιχα. Συνεπώς ο ιός καταλαμβάνει τον έλεγχο τόσο του κυτταρικού κύκλου όσο και του μηχανισμού της απόπτωσης. Οι ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες TP53 και RB1 ελέγχουν επιπλέον αμέσως την μεταγραφική ενεργότητα της RNA πολυμεράσης III (RNA polymerase III, RNA pol III). Οι αλλαγές στην ενεργότητα αυτού του ενζύμου αντικατοπτρίζονται στην βιοσυνθετική ικανότητα του κυττάρου. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της RNA pol III μεταγραφής σε κύτταρα καρκίνου τραχήλου της μήτρας μολυσμένα με υψηλού κινδύνου τύπους του ιού HPV, αναφορικά με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, το βαθμό ενεργοποίησης του κυττάρου και της δέσμευσής του για μίτωση, διαβαίνοντας το κατώφλι από τη φάση του κυτταρικού κύκλου G1 στη φάση S. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκαν βιοψίες από 35 περιστατικά καρκίνου τραχήλου της μήτρας, 26 υψηλού (HSIL) και 33 χαμηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων (LSIL) καθώς και 28 φυσιολογικοί τράχηλοι της μήτρας σαν ομάδα ελέγχου. Από το υλικό αυτό απομονώθηκε ολικό DNA, RNA και πρωτεΐνες. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος με τη μέθοδο της PCR της παρουσίας DNA του ιού HPV σε όλα τα δείγματα και ταυτοποίηση του τύπου του ιού, όπου αυτός εντοπίσθηκε. Σε κανένα δείγμα της ομάδας ελέγχου των φυσιολογικών τραχήλων της μήτρας δεν εντοπίσθηκε HPV DNA. Επιπλέον εξετάστηκε το ενδεχόμενο το DNA του ιού να έχει ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή ή να διατηρείται επισωματικώς. Η ενσωμάτωση του DNA του ιού στο γονιδίωμα του ξενιστή έχει σαν αποτέλεσμα την απώλεια της έκφρασης του Ε2 γονιδίου του HPV που κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη που καταστέλλει την έκφραση των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7. Έτσι οι τελευταίες εκφράζονται σε πολύ υψηλότερα επίπεδα από ότι όταν ο ιός εντοπίζεται επισωματικώς. Τα επίπεδα λειτουργίας της RNA pol III μεταγραφής και η ρύθμισή της σε κύτταρα καρκίνου τραχήλου της μήτρας μολυσμένα με υψηλού κινδύνου HPV εξετάστηκαν. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε RT-PCR ανάλυση των πρωτογενών μεταγράφων γονιδίων κλάσεως ΙΙΙ, γονιδίων που μεταγράφονται από την RNA pol III, όπως tRNAs (tRNATyr, tRNAArg, tRNALeu), 5S rRNA, MRP RNA, ένα μόριο RNA που χρειάζεται για την αντιγραφή του μιτοχονδριακού DNA και την ωρίμανση των μεγάλων rRNA, και του 7SK RNA, που ρυθμίζει έναν μεταγραφικό παράγοντα επιμήκυνσης της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Διαπιστώθηκε πως οι βιοψίες καρκίνου τραχήλου της μήτρας εκφράζουν σε υψηλότερα επίπεδα τα tRNAs και 5S rRNA σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Παράλληλα, όταν ο HPV είχε ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή η έκφραση των προϊόντων της RNA pol III ήταν υψηλότερη. Τα 7SK και MRP μετάγραφα παρουσίασαν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης κάτι που πιθανά οφείλεται στην διαφορετική διάταξη των υποκινητών που χρησιμοποιούνται στην μεταγραφή τους. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα της RNA pol III, TFIIIC2, ο οποίος αποτελείται από πέντε υπομονάδες, TFIIICα, TFIIICβ, TFIIIC90, TFIIIC102 και TFIIIC63, έδειξε σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων. Φαίνεται πως ο TFIIIC2 δεν είναι περιοριστικός παράγοντας για την RNA pol III μεταγραφή στα κύτταρα του τραχήλου της μήτρας και πως ο HPV δεν επάγει την έκφραση των υπομονάδων, ενώ η ενσωμάτωση του ιού στο γονιδίωμα του ξενιστή τα επάγει. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα της RNA pol III, TFIIIΒ, ο οποίος αποτελείται από τρεις υπομονάδες, τις TBP, Brf1 και Bdp1, έδειξε πως ο Brf1 συσχετίζεται με τη νόσο, την παρουσία HPV, επισωματικώς ή ενσωματωμένου στο γονιδίωμα του ξενιστή και τα επίπεδα μεταγραφής της RNA pol III. Τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Brf1 δεν συνδέονται με την αδρανοποίηση των TP53 και RB1 από τις Ε6 και Ε7 αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα οδηγούν στην υπόθεση πως ο Brf1 είναι περιοριστικός παράγοντας της RNA pol III μεταγραφής στα κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Με δεδομένο πως η RNA pol III μεταγραφή αυξάνεται σημαντικά κατά την διάρκεια της μετάβασης από την G1 στην S φάση του κυτταρικού κύκλου εξετάστηκε η απόκριση του Brf1 στις φάσεις G1 και S, σε κυτταρικές σειρές HeLa που διαμολύνθηκαν με φορέα που υπερεκφράζει τον Brf1 και συγχρονίστηκαν. Έτσι διαπιστώθηκε πως ο Brf1 ενεργοποιεί την μεταγραφή των tRNA και 5S rRNA στην φάση G1 και του 5S rRNA στην φάση S του κυτταρικού κύκλου. Συμπερασματικά, τρεις συμπληρωματικοί μηχανισμοί μπορεί να είναι υπεύθυνοι για τα υψηλά επίπεδα παραγωγής tRNA και 5S rRNA στα κύτταρα καρκίνου της μήτρας μολυσμένα από υψηλού κινδύνου ιό HPV: α) αδρανοποίηση της TP53 από την Ε6, β) αδρανοποίηση της RB1 από την Ε7 και γ) επαγωγή της μεταγραφής του Brf1. Τελικό αποτέλεσμα είναι η αύξηση της βιοσυνθετικής ικανότητας των καρκινικών κυττάρων η οποία μπορεί να συμβάλλει στον εκτός ελέγχου πολλαπλασιασμό τους. Για την μελέτη της μετάβασης του κυτταρικού κύκλου από την φάση G1 στην S σε κύτταρα καρκίνου τραχήλου της μήτρας μολυσμένα από υψηλού κινδύνου τύπο του ιού HPV, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των επιπέδων έκφρασης 24 γονιδίων. Τα γονίδια που εξετάστηκαν περιλαμβάνουν κύρια και ρυθμιστικά γονίδια του κυτταρικού κύκλου όπως κυκλίνες (cyclins, CCNs) και κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (cyclin-dependent kinases, CDKs), αναστολείς των CDKs (CDKNs) και των δύο οικογενειών Cip/Kip και ΙΝΚ4, γονίδια της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων E2F, γονίδια της οικογένειας RB1 (pocket proteins) και TP53 καθώς και γονίδια των οποίων η μεταγραφή ελέγχεται από τους μεταγραφικούς παράγοντες E2F και τα οποία είναι απαραίτητα κατά την φάση S του κυτταρικού κύκλου. Η μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από την φάση G1 στην S απαιτεί την παρουσία των δύο ολοενζύμων, κυκλίνη D με Cdk4 και Cdk6, καθώς και κυκλίνη Ε με Cdk2. Η ρύθμιση του σημείου αυτού ελέγχου (checkpoint) του κυτταρικού κύκλου βασίζεται στα μονοπάτια της TP53 (TP53-MDM2-CDKN1A-CDKN2D) και RB1 (RB1-E2F-CCND1-CDK4-CDK6-CDKN2A). Έτσι φαίνεται πως η αδρανοποίηση των πρωτεϊνών TP53 και RB1 από τις ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 των υψηλού κινδύνου τύπων του HPV είναι ικανό γεγονός για να προκαλέσει απορύθμιση του G1/S ελέγχου και καρκινογένεση. Κάτι τέτοιο όμως δεν συμβαίνει στην πράξη. Η αδρανοποίηση είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την ογκογένεση στον τράχηλο της μήτρας όχι όμως και ικανή συνθήκη που να μετατρέπει φυσιολογικά κύτταρα σε αθανατοποιημένα ή καρκινικά. Επιπρόσθετα γεγονότα χρειάζονται ώστε μέσα από γενετικές και επιγενετικές αλλαγές, από την ενεργοποίηση πρωτο-ογκογονιδίων και την απώλεια ογκοκατασταλτικών αλλά και μέσα από ανοσολογικές αποκρίσεις, τα μολυσμένα με υψηλού κινδύνου HPV κύτταρα του τραχήλου της μήτρας να εξελιχθούν σε καρκινικά. Οι ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις του καρκίνου της μήτρας (HSIL και LSIL) που έχουν υψηλού κινδύνου HPV και εκφράζουν τις Ε6 και Ε7 δεν δείχνουν την ανάπτυξη ή την επιθετικότητα των όγκων, ενώ ο καρκίνος του τραχήλου αναπτύσσεται σπάνια και μετά από δεκαετίες έπειτα από μόλυνση με υψηλού κινδύνου HPV. Οι παρατηρήσεις αυτές μας δείχνουν πως άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες της G1/S μετάβασης μπορεί να δρουν ώστε να αντισταθμίζουν την επιθετική αύξηση. Από τα 24 γονίδια που εξετάστηκαν πέντε, τα RBL2, E2F2, CDK6, CCNE1 και MYC, βρέθηκαν να υπερεκφράζονται στον καρκίνο του τραχήλου στο 80%, 80%, 97%, 74% και 74% των περιστατικών που εξετάστηκαν, αντίστοιχα. Οκτώ γονίδια βρέθηκαν να υπερεκφράζονται τόσο στον καρκίνο του τραχήλου όσο και στο HSIL, τα E2F1 στο 84% και 71% των καρκίνων και HSILs, αντίστοιχα, E2F3 στο 81% και 74%, E2F5 στο 86% και 81%, CCND1 στο 77% και 52%, CDK2 στο 88% και 62%, CDKN1B στο 86% και 77%, PCNA στο 89% και 69%, καθώς και το POLA στο 62% και 52%. Μόνο πέντε από τα 24 γονίδια που εξετάστηκαν βρέθηκαν σε υψηλά επίπεδα και στις τρεις ομάδες δειγμάτων καρκίνο τραχήλου, HSIL και LSIL σε σχέση με την ομάδα ελέγχου τα TP53 αυξημένο στο 80% των όγκων, 69% των HSILs και 64% των LSILs, E2F4 στο 89%, 81% και 76%, CDKN1A στο 82%, 73% και 70%, CDKN2A στο 86%, 82% και 77% καθώς και το DHFR στο 75%, 70% και 62%, αντίστοιχα. Το γονίδιο MDM2 παρουσιάζει ένα μοναδικό πρότυπο με υπερέκφραση στο 88% και 73% των HSILs και LSILs, αντίστοιχα. Το RBL1 βρέθηκε να υποεκφράζεται στο 97%, 88% και 73% των όγκων, HSILs και LSILs. Το TP73 παρουσίασε χαμηλότερα επίπεδα στο 60% των καρκίνων του τραχήλου. Ωστόσο, οι ισομορφές του TP73 που περιείχαν το εξόνιο 13 ήταν σημαντικά αυξημένες στο 73% και 69% των καρκίνων και HSILs, ενώ οι ισομορφές που περιείχαν το εξόνιο 2 βρέθηκαν μειωμένες στο 97% και 73% των όγκων και HSILs αντίστοιχα. Τρία γονίδια, τα RB1, CDK4 και CDKN2D, έδειξαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν πως η απορύθμιση της G1/S μετάβασης κατά την διάρκεια της καρκινογένεσης του τραχήλου της μήτρας είναι μια προοδευτική διαδικασία. Συγκεκριμένες ομάδες γονιδίων ενεργοποιούνται πολύ νωρίς στις προ-καρκινικές καταστάσεις LSIL και HSIL ενώ άλλα ενεργοποιούνται αργότερα κατά τον καρκινικό μετασχηματισμό των κυττάρων. Τα δεδομένα αυτά έχουν σημαντική κλινική αξία. Ιεραρχική ταξινόμηση των 122 συνολικά δειγμάτων που εξετάστηκαν ανάλογα με την έκφραση των 24 γονιδίων που μελετήθηκαν διαχώρισε τα δείγματα σε ομάδες ανάλογα με την νόσο με ελάχιστα λάθη (6,6%). Παράλληλα τα γονίδια ομαδοποιήθηκαν σε 3 ομάδες ανάλογα με την έκφρασή τους, υψηλή, CDK4, E2F3, E2F5, E2F1, RB1 PCNA, CDKN1B, TP53 και DHFR, μέτρια, POLA, CCND1, CDK2, E2F4, CDK6, MDM2, CDKN2D, MYC, CDKN1A, RBL2, E2F2, TP73 ισόμορφα που περιέχουν το εξόνιο 13, CCNE1 και CDKN2A, και χαμηλή, TP73 ισόμορφα που περιέχουν το εξόνιο 2, RBL1 και TP73. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν πιθανές διαγνωστικές εφαρμογές