GRIP functions in neuronal plasticity

Synaptic plasticity is the basis for information storage, learning and memory and is achieved by modulation of the synaptic transmission. The amount of active AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionic acid) receptors at the synapse determines the transmission properties, therefore the regulation of AMPA receptor trafficking affects the synaptic strength. The protein GRIP (glutamate receptor interacting protein) binds to AMPA receptors and is one of the important regulators of AMPA receptor stability at the synapse (Dong et al., 1997; Osten et al., 2000). Previous studies have shown that the ablation of ephrinB2 or ephrinB3 in the nervous system leads to severe defects in hippocampal LTP (long term potentiation) and LTD (long term depression) (Grunwald et al., 2004). We found that ephrinB2 ligands play an important role in the stabilization of AMPA receptors at the cellular membrane (Essmann et al., 2008). Treating cultured hippocampal neurons with AMPA resulted in a robust AMPA receptor internalization, which could be inhibited by simultaneous ephrinB2 activation with soluble EphB4-Fc fusion proteins. Conditional hippocampal ephrinB2 knock-out (KO) neurons showed enhanced constitutive internalization of AMPA receptors. Interaction and interference experiments revealed that ephrinB ligands and AMPA receptors are bridged by GRIP. This interaction is regulated by phosphorylation of a single serine residue in close proximity to the C-terminal PDZ protein target site in ephrinB ligands (Essmann et al., 2008). To investigate the in vivo relevance of this previously undescribed feature of ephrinB reverse signaling, we generated ephrinB2 S-9>A knock-in mice, where the serine at position -9 was replaced by an alanine to prevent phosphorylation. The mutated ephrinB2 of this mouse line was expressed and able to form clusters following stimulation with the preclustered receptor EphB4-Fc. Surface ephrinB2 cluster size and cluster number was slightly smaller in comparison to wild type (WT) mice. Analyzing AMPA receptor internalization, we oserved an increased basal GluR2 endocytosis in cultured hippocampal neurons of ephrinB2 S-9>A mice. Dendrite and spine morphology was similar in pyramidal CA1 neurons of brain slices from adult ephrinB2 S-9>A and WT mice, suggesting a redundancy between the different ephrinB familily members. Apart from regulating AMPA receptor stability at the synapse, GRIP1 also has an important role in the secretory pathway to deliver cargo proteins along microtubules to dendrites and synapses (Setou et al., 2002). Proteins involved in synaptic transmission and plasticity, as well as lipids required for the outgrowth and remodeling of dendrites and axons have to be transported. We showed in our laboratory with a directed proteomic analysis using the tandem affinity purification-mass spectrometry methodology (Angrand et al., 2006) and with immunoprecipitation assays with brain lysates that the small regulatory protein 14-3-3 interacts with GRIP1. Further immunoprecipitation assays with lysates from HeLa cells transfected with various parts and sequence mutants of GRIP1 revealed that threonine 956 in the linker region L2 between PDZ6 and PDZ7 of GRIP1 is necessary for the interaction with 14-3-3. GRIP1 has been postulated to influence dendritic arborization and maintenance in hippocampal neurons in culture due to defective kinesin-dependent transport along microtubules (Hoogenraad et al 2005). In order to address the role of the association of GRIP1 and 14-3-3 in dendritogenesis, we transfected rat hippocampal neurons with GRIP1-WT and GRIP1 mutants and performed Sholl analysis to evaluate dendritic arborization defects. We could observe striking increased formation and growth of dendrites in developing neurons as well as in mature neurons overexpressing GRIP1-WT. However, overexpression of GRIP1-T956A, where the threonine 956 was replaced by an alanine to prevent phosphorylation, did not show enhanced dendritogenesis, indicating a role for threonine 956 phosphorylation in dendrite branching. To investigate the importance of the interaction between GRIP1 and 14-3-3 in vivo, we generated transgenic mouse lines with a GRIP1-T956A transgene or a GRIP1-WT transgene as control. These mice were crossed with heterozygous GRIP1 mice and by further breedings we obtained some surviver mice carrying either the wild type or the mutated GRIP1 transgene in the usually embryonic lethal GRIP1-KO background (Bladt et al., 2002; Takamiya et al., 2004). In embryonic day (E) 14.5 cultured hippocampal GRIP1-KO neurons we could observe reduced dendritic growth. We also showed reduced GluR2 staining on the dendritic surface in cultured hippocampal neurons from GRIP1-KO and GRIP1-KO neurons containing the GRIP1-T956A transgene. GRIP1-KO neurons containing the GRIP1-WT transgene showed a similar surface GluR2 signal intensity as WT neurons. Reduced surface GluR2 staining in GRIP1-KO neurons and GRIP1-KO neurons with the GRIP1-T956A transgene might be a consequence of defective kinesin-dependent transport of GluR2 to dendrites, indicating an important role of threonine 956 phosphorylation of GRIP1 for GluR2 trafficking.Synaptische Plastizität im Gehirn ist von essentieller Bedeutung für die Gedächtnisbildung. Die Signalstärke an der Synapse wird unter anderem durch die Anzahl der AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionic acid) Rezeptoren an der postsynaptischen Membran bestimmt. Daher ist es wichtig, die Signalwege, die für den Transport und die Stabilisation von AMPA Rezeptoren an der Membran verantwortlich sind, zu untersuchen. Das Protein GRIP (glutamate receptor interacting protein) bindet an AMPA Rezeptoren und spielt eine wichtige Rolle für ihre Lokalisation (Dong et al., 1997). Veränderung der GRIP-GluR2 Bindestelle reduziert die synaptische Lokalisation von GluR2 (Osten et al., 2000). Es gibt verschiedene GRIP Proteine. GRIP1 enthält sieben PDZ (postsynaptic density-95/Disc large/zona occludens-1) Domänen, ABP (AMPA receptor binding protein) enthält in der langen Isoform sieben PDZ Domänen und wird auch GRIP2 genannt, in der kurzen Isoform besteht ABP aus sechs PDZ Domänen (Dong et al., 1999b). PDZ Domänen sind Proteinmotive, die aus ungefähr 90 Aminosäuren bestehen und durch ihre Fähigkeit, an kurze Peptide am Carboxy-Ende anderer Proteine zu binden, eine wichtige Funktion bei der Gerüstbildung, besonders an Synapsen, übernehmen. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf GRIP1. Zu den Interaktionspartnern von GRIP1 gehören die Eph Rezeptoren (Rezeptortyrosinkinasen) und ihre membrangebundenen Liganden, die Ephrine. Eph Rezeptoren und Ephrine sind wichtige Regulatoren bei der Wegfindung von Axonen, Zellmigration, Segmentation und Angiogenese (Kullander and Klein, 2002; Palmer and Klein, 2003). Eine Besonderheit ist, dass neben der vorwärts gerrichteten Signalübertragung auch eine reverse Signalübertragung stattfinden kann, bei der der Ligand das Signal in die Zelle weitergibt (Palmer et al., 2002). Man unterscheidet aufgrund von Bindungseigenschaften und Struktur zwischen Eph Rezeptoren und Ephrin Liganden der Klasse A und B. EphrinA Liganden binden in der Regel EphA Rezeptoren, EphrinB Liganden EphB Rezeptoren. Wir haben in unserem Labor gezeigt, dass GRIP an EphrinB2 binden muss, um seine Rolle bei der Stabilisation von AMPA Rezeptoren an der Membranoberfläche auszuüben (Essmann et al., 2008). Stimulation von kultivierten hippokampalen Neuronen mit AMPA führte zu verstärkter Internalisierung der AMPA Rezeptor Untereinheit GluR2. Die erhöhte Internalisierung konnte durch gleichzeitige Stimulierung der EphrinB2 Liganden mit dem zuvor geclusterten spezifischen Rezeptor EphB4-Fc aufgehoben werden. Dies wurde mit dem „Antibody feeding assay“ gezeigt, bei dem die Neuronen mit einem extrazellulären anti-GluR2 Antikörper gefärbt wurden. Nach Stimulation wurden die Neuronen fixiert und GluR2 an der Zelloberfläche wurde mit einem grün fluoreszierenden Zweitantikörper gefärbt, internalisiertes GluR2 nach Permeabilisierung der Neuronen mit einem rot fluoreszierenden Zweitantikörper. EphrinB2 Knock-out (KO) Mäuse sind aufgrund schwerer vaskulärer Entwicklungsdefekte embryonisch lethal (Adams et al., 2001; Wang et al., 1998). Konditionelle EphrinB2-KO Mäuse, bei denen EphrinB2 spezifisch im Nervensystem entfernt wurde, sind überlebensfähig (Grunwald et al., 2004). Hippokampale EphrinB2-KO Neuronen dieser Mäuse zeigten erhöhte konstitutive AMPA Rezeptor Internalisierung und reduzierte synaptische Übertragung, was auf eine reduzierte AMPA Rezeptor Anzahl an der Synapse hinweist (Essmann et al., 2008). Die sechste PDZ Domäne von GRIP ist für die Bindung an EphrinB Liganden verantwortlich (Bruckner et al., 1999; Torres et al., 1998). Überexpression der sechsten PDZ Domäne von GRIP1 in kultivierten hippocampalen Neuronen verhindert die Bindung von endogenem GRIP an EphrinB Liganden. Daher konnte hier die AMPA induzierte Internalisierung von GluR2 nicht durch gleichzeitige Stimulation mit dem zuvor geclusterten spezifischen Rezeptor EphB4-Fc aufgehoben werden. Es wurde zuvor gezeigt, dass EphrinB Liganden neben Tyrosinen auch an Serinen phosphoryliert werden können (Palmer et al., 2002). Wir konnten mit Hilfe von Immunpräzipitationen zeigen, dass Phosphorylierung der Aminosäure Serin an der Stelle -9 in der Nähe der PDZ Protein Bindestelle am Carboxy-Ende von EphrinB2 für die Bindung an GRIP verantwortlich ist. Die Bedeutung der Interaktion zwischen EphrinB2 und GRIP für die Stabilisation von AMPA Rezeptoren an der Oberfläche konnte durch Transfektion hippokampaler EphrinB2-KO Neuronen mit verschiedenen EphrinB2 Konstrukten gezeigt werden. Expression von Wildtyp (WT) EphrinB2 und EphrinB2 S-9>E, wo das Serin an der Position -9 durch ein Glutamat ausgetauscht worden ist, was einer konstitutiven Phosphorylierungsstelle entspricht, führte zur Stabilisation der AMPA Rezeptoren an der Membran. Die mit EphrinB2 S-9>A transfizierten EphrinB2-KO Neuronen, wo das Serin durch ein Alanin ersetzt worden ist und dadurch eine Phosphorylierungsstelle fehlt, zeigten hingegen weiterhin erhöhte GluR2 Endozytose...