Structural and functional characterization of the cytokinin receptor CRE1/AHK4 of Arabidopsis thaliana

Cytokinine sind eine Gruppe von Pflanzenhormonen, die an einer Vielzahl von Prozessen des pflanzlichen Wachstums und der Entwicklung beteiligt sind. Hierzu zählen z. B. die Meristemfunktionen in Spross und Wurzel, die Blattseneszenz oder auch die Differenzierung der Leitgewebe. Chemisch betrachtet handelt es sich um N6-substituierte Adeninderivate, die anhand ihrer Seitenkettenkonfiguration als isoprenoide oder aromatische Cytokinine eingeordnet werden. Im derzeitigen Modell wird die Cytokininsignaltransduktion durch die Bindung des Hormons an membranständige Rezeptorproteine eingeleitet, die Sensor-Histidin-Kinasen sind. Diese Rezeptoren bilden in Arabidopsis thaliana eine Proteinfamilie bestehend aus drei Mitgliedern: CRE1/AHK4, AHK3 und AHK2. Strukturell gliedern sich alle drei Rezeptoren in eine N-terminale und vermutlich extrazelluläre CHASE Domäne, die als Bindungsdomäne für Cytokinin in Frage kommt und die von zwei Transmembrandomänen umschlossen ist sowie in einen C-terminalen Bereich, der die Histidin-Kinase- und die Receiver-Domäne umfasst. In dieser Promotionsarbeit wurde zunächst experimentell durch Anwendung eines bakteriellen Cytokininbindungsassays die Bindungsdomäne für das Hormon exemplarisch von CRE1/AHK4 kartiert. Es stellte sich heraus, dass die vermutlich extrazelluläre CHASE Domäne des Rezeptors für die Bindung des Hormons notwendig und hinreichend ist, jedoch zumindest im hier verwendeten Testsystem die angrenzenden Transmembranbereiche für die Funktionalität von CHASE benötigt wurden. Auch für die beiden anderen Rezeptoren AHK3 und AHK2 war eine spezifische Cytokininbindung der jeweiligen CHASE-TM Domänen nachweisbar. Im Folgenden wurde eine bioinformatische Analyse der CHASE Domäne von CRE1/AHK4 basierend auf Sequenz- und Phylogenieinformationen durchgeführt. Ziel dieser Analyse war es, Aminosäurepositionen zu identifizieren, die für die Cytokininbindung von entscheidender Bedeutung sind. Die nachfolgende experimentelle Untersuchung der anhand der computergestützten Analyse gefundenen Aminosäurereste durch Überprüfung der Cytokininbindungsfähigkeit generierter Rezeptormutanten von CRE1/AHK4 konnte den Nutzen der bioinformatischen Vorhersagen bestätigen. Mutationen an vier von fünf selektierten Positionen resultierten entweder in einem vollständigen Verlust (F304A und T317A) oder zumindest in einer starken Verminderung (W244A und R304A) der Hormonbindung. Mit dem Ziel eines tieferen Verständnisses der Struktur-Funktions-Beziehungen am Cytokininrezeptor und um die Ergebnisse aus der vorangegangenen Mutationsanalyse zu validieren, wurde exemplarisch die Lösung der räumlichen Struktur der CHASE Domäne von CRE1/AHK4 angestrebt. Die Versuche konzentrierten sich auf die CHASE-TM Domäne, da für dieses Protein in E. coli eine Cytokininbindung nachgewiesen werden konnte. Die Experimente zur Proteinexpression ergaben, dass CHASE-TM nur in einem zellfreien System überexprimiert werden konnte, während Versuche in E. coli oder einem pflanzlichen Expressionssystem keinen Erfolg hatten. Die Ergebnisse lassen ein hohes toxisches Potential für dieses Protein vermuten, welches auch für den Volllängenrezeptor CRE1/AHK4 in dieser Arbeit beobachtet werden konnte. Die lösliche CHASE Domäne konnte denaturierend aus E. coli gereinigt werden, der Nachweis einer Cytokininbindung an das renaturierte Protein blieb hingegen ohne Erfolg. Die zellfrei exprimierte CHASE-TM Domäne konnte mittels einer Affinitätsreinigung zu hoher Reinheit gebracht und eine charakteristische Faltung sowie eine spezifische Cytokininbindung für das gereinigte Protein nachgewiesen werden. Die Kristallisation der Domäne war jedoch letztendlich erfolglos, da die Herstellung einer hochkonzentrierten Proteinlösung durch Präzipitatbildung erschwert wurde und damit eine notwendige Voraussetzung für die Ausbildung von Proteinkristallen nicht erfüllt war. Es wurde nur eine Proteinkonzentration von 2 mg/ml erreicht. Parallel zur Kristallisation von CHASE-TM wurde eine NMR-spektroskopische Analyse der Domäne begonnen. Diese ergab, dass neben der geringen Proteinkonzentration vor allem das für die Reinigung verwendete Detergenz ß-DDM oder auch LPPG ungeeignet waren, um ein auswertbares aufgelöstes Spektrum zu erhalten, da viele Bereiche im Spektrum durch starke Detergenzsignale überlagert waren. Zumindest ein umfassender Detergenzscreen wäre für eine NMR-Analyse der CHASE-TM Domäne notwendig gewesen. Zum Abschluss wurden im Rahmen dieser Promotionsarbeit transiente Expressionsstudien zur subzellulären Lokalisation mit GFP-Fusionsproteinen sowie in planta Analysen zur Dimerisierung der Cytokininrezeptoren mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BiFC) unternommen. Vor allem die Experimente in Tabakepidermiszellen zeigten für CRE1/AHK4 und AHK3 eine überwiegende im Gegensatz zum bisherigen Modell der Cytokininsignaltransduktion stehende Lokalisation im Endoplasmatischen Retikulum (ER), die zudem von Cytokinin oder dem Transportinhibitor Brefeldin A unabhängig war. Ein konstitutives Recycling von Rezeptor-GFP-Fusionsproteinen zwischen dem ER und der Plasmamembran, wie zum Teil für andere pflanzliche Rezeptoren nachgewiesen, konnte nicht beobachtet werden. Die Experimente zum Dimerisierungsverhalten der Cytokininrezeptoren ergaben ein hohes Maß an Unspezifität, da alle möglichen Homo- bzw. Heterodimere zwischen den drei Rezeptoren CRE1/AHK4, AHK3 und AHK2 mittels BiFC nachgewiesen werden konnten. Diese Ergebnisse stehen im Kontrast zu bisherigen Ergebnissen, was die Notwendigkeit weiterführender Analysen zur Dimerisierung auch hinsichtlich einer möglichen biologischen Relevanz der nachgewiesenen Dimere begründet.Cytokinins are a class of plant hormones which have been implicated in a broad range of developmental and growth processes including root and shoot meristem function, leaf senescence or vascular development. Natural cytokinins are adenine derivatives that carry an isoprenoide or an aromatic side chain at the N6 atom of the purine ring. In the current model of the cytokinin signaling pathway the hormone is perceived by a family of membrane-bound receptor histidine kinases comprising three members in Arabidopsis thaliana: CRE1/AHK4, AHK3 and AHK2. The receptors are composed of an N-terminally located putative extracellular CHASE domain which is considered to be the cytokinin binding domain and which is flanked by two membrane-spanning domains. At the C-terminal end there are the kinase and the receiver domain which are responsible for the phosphorelay. In the first part of this thesis I mapped the cytokinin binding domain of CRE1/AHK4 by testing the binding activity of different truncated versions of the full length receptor in a bacterial hormone binding assay. This assay revealed that the CHASE domain is necessary and sufficient for binding of cytokinin. The results also suggested that the two membrane-spanning domains are needed to form a functional CHASE domain. For AHK3 and AHK2 the corresponding CHASE-TM domains showed specific cytokinin binding as well. The next step of the characterization of the CHASE domain was to identify functionally important residues. By using a bioinformatics approach based on sequence and phylogenetic information of distantly related CHASE domains five amino acid positions potentially involved in cytokinin binding were identified. Subsequently the selected amino acids were mutated to alanine and the cytokinin binding ability of the mutated CRE1/AHK4 receptor variants was tested. Mutations of two of the five candidate residues led to a complete abolishment of hormone binding (F304A and T317A) and two other amino acid substitutions resulted in a strongly reduced binding capacity (W244A and R305A). These results clearly demonstrate the usefulness of the selected bioinformatics approach in connection with experimental work. To get a deeper understanding of the structure-function relation at the receptor level and to verify the findings of the previous study the next aim was to exemplarily crystallize the CHASE domain of CRE1/AHK4. The following experiments focused on the CHASE-TM domain because this protein showed a specific cytokinin binding activity in the bacterial hormone binding assay, comparable to the full length receptor CRE1/AHK4. The CHASE-TM protein could only be overexpressed in a cell-free system whereas it showed a highly toxic potential in standard E. coli expression systems or as well in a plant protein expression system based on plant viral vectors. The full length receptor CRE1/AHK4 could only be produced at low amounts in E. coli and the cell-free system. The soluble CHASE domain could be purified under denaturing conditions from bacterial inclusion bodies but did not show any specific cytokinin binding after refolding, which supported the idea of the necessity for the transmembrane regions to form a functional CHASE domain. The cell-free expressed CHASE-TM protein was cleaned to high purity by affinity chromatography and a characteristic folding and specific cytokinin binding activity were proven for the purified domain. However, the crystallization of the CHASE-TM domain was not successful because of precipitation of the protein during the essential concentration procedure. The protein could only be concentrated to 2 mg/ml. In parallel, I attempted to perform NMR spectroscopic analysis with the low concentrated and purified CHASE-TM protein. Unfortunately, the NMR spectra did not show any dispersion neither with ß-DDM nor LPPG as detergent. Many parts of the spectra showed a strong overlay with detergent signals which made it impossible to assign certain peaks specifically to the CHASE-TM domain. As a result, at least an intensive detergent screen is needed to find an appropriate detergent for NMR analysis of the CHASE-TM protein. Within the final part of this thesis I did on the one hand studies on the subcellular localization of the cytokinin receptors after transient expression of the particular GFP fusion proteins in tobacco epidermal leaves and Arabidopsis protoplasts. On the other hand I investigated the dimerization properties of the receptors in planta by the non-invasive bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technique. In particular the results of the localization studies in tobacco leaves showed a Brefeldin A and cytokinin independent predominant localization of CRE1/AHK4 and AHK3 within the endoplasmic reticulum (ER). This is in clear contrast to the current model of cytokinin signaling, which suggests the plasma membrane as the residence of the cytokinin receptors. Additionally, any constitutive recycling of receptor molecules between the ER and the plasma membrane was not observed which a characteristic feature of some other plant receptors is. The results of the BiFC experiments showed in contrast to previous published results no specificity with respect to the dimerization within the cytokinin receptor family. All possible possible homo- and heterodimers between the receptors were observed through the detection of YFP fluorescence. These results give reasons for the need for further analyses, also regarding the biological relevance of the detected receptor dimers