Internalisation desensitisation and polarised surface expression of endothelin B-receptors

0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis 1\. Einleitung 11 1.1. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 11 1.2. Die Endotheline und ihre Rezeptoren 12 1.3. Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des Endothelins 15 1.4. Signalkaskaden der Endothelin-Rezeptoren 16 1.5. Endothelin-induzierte Vasokonstriktion 18 1.6. Rezeptor-vermittelte Endozytose 19 1.7. Transportprozesse in polarisierten Zellen 22 1.8. Visualisierung von intrazellulären Transportprozessen 23 1.9. Fragestellung 25 2\. Material und Methode 26 2.1. Material 26 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 26 2.1.2 Geräte und Rechner 28 2.1.3 Bakterienstämme und Zellinien 30 2.1.4 Desoxyribonucleotide 31 2.1.5 Medien und Agarplatten für E.coli 32 2.2. Methoden 33 2.2.1 Methode zur Aufreinigung von DNS 33 2.2.2 Amplifizierung von DNS durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) 34 2.2.3 Spezifische Spaltung von DNS durch Verdau mit Restriktionsendonukleasen 35 2.2.4 DNS-Sequenzierung nach der Dideoxymethode 35 2.2.5 Horizontale Gelelektrophorese 36 2.2.6 Eluierung von DNS Fragmenten aus Agarose-Gelen mit dem Gene Clean Kit 37 2.2.7 Ligation von DNS Fragmenten 37 2.2.8 Herstellung kompetenter Zellen und Transformation 38 2.2.9 Zellkultur 38 2.2.10 125Iod-Endothelin1 Bindung und Verdrängung an Gesamtmembranen 40 2.2.11 Internalisierungsexperimente 41 2.2.12 Inhibition der Clathrin-abhängigen Internalisierung 42 2.2.13 Kolokalisation von Fluo-ET1 mit DiI-LDL oder TRITC-Transferrin 42 2.2.14 Konfokale- bzw. Epifluoreszenz-Mikroskopie 43 2.2.15 Biotinilierung von Oberflächenproteinen 43 2.2.16 Inositolphosphat Assay 44 2.2.17 cAMP-Radioimmunoassay (RIA) 45 3\. Ergebnisse 46 3.1. Pharmakologische Eigenschaften der Endothelin-Rezeptoren, im Vergleich mit ihren GFP-Fusionsproteinen 47 3.2. Internalisierung und intrazellulärer Transport 48 3.2.1 Visualisierung der Endozytose von Endothelin-Rezeptoren 48 3.2.2 Wiedererscheinen des ETB Rezeptors an der Zelloberfläche nach erfolgter Internalisierung 52 3.2.3 Kolokalisation mit Fluorochrom-markiertem Low-Density-Lipoprotein (LDL) 54 3.2.4 Sucrose inhibiert die Clathrin-abhängige Endozytose des ETB Rezeptors 57 3.3. Strukturelle Motive für die Oberflächenexpression des ETB Rezeptors in polarisierten MDCK-Zellen 57 3.3.1 Verteilung der ETB/GFP Konstrukte in MDCK-Zellen 59 3.3.2 Radioaktiver Ligand-Bindungs-Assay an MDCK-Zellen 59 3.3.3 Biotinilierungs-Assay zur Messung der apikalen und basolateralen Membranoberflächen 61 3.3.4 Signaltransduktion des ETB Rezeptors an polaren MDCK-Zellen 62 4\. Diskussion 65 4.1. Subtyp spezifische Desensitisierung der Endothelin-Rezeptoren 66 4.2. Differenzierte Internalisierung des Endothelin-Rezeptor Subtypen 67 4.3. Strukturelle Motive für die Oberflächenexpression in polarisierten MDCK-Zellen 70 4.4. Zusammenfassung und Ausblick 72 Literaturverzeichnis 73 Klonierung 86 Lebenslauf 87 Danksagung 88Endotheline (ET1, ET2, ET3) sind Peptide von 21 Aminosäuren, die ihre Wirkung über zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren entfalten: 1) Den v.a. auf vaskulären Muskelzellen exprimierten Endothelin A-Rezeptor (ETA) und 2) den in Endothelzellen exprimierten Endothelin B-Rezeptor (ETB). Der ETA vermittelt eine lang-anhaltende Vasokonstriktion, der ETB eine kurzfristige Vasodilatation. Die Ursache für die unterschiedliche Dauer der durch die Endothelin-Rezeptorsubtypen vermittelten Gefäßreaktionen ist bislang unklar. Unterschiede der Internalisierung und des intrazellulären Transports könnten hier eine mögliche Ursache sein. Während für den ETA ein Recycling in glatten Muskelzellen beschrieben wurde, lagen für den ETB bisher keine Untersuchungen vor. In der vorgelegten Arbeit wurde durch Verwendung von fluoreszierendem ET1 und Endothelin-Rezeptor/GFP-Fusionsproteinen gezeigt, daß der ETB nach Endothelin-1 (ET1) Bindung innerhalb weniger Minuten über einen Sucrose- sensitiven, d.h. Clathrin-vermittelten Weg internalisiert wird. Der Ligand verbleibt mit dem Rezeptor über mehrere Stunden in einem stabilen Komplex und wird in späte Endosomen/Lysosomen transportiert und schließlich abgebaut ("Downregulation"). Diese an transfizierten CHO-Zellen durchgeführten Analysen konnten auch an primär kultivierten Astrozyten bestätigt werden. Die Downregulation von Rezeptor und Ligand ist für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bislang einzigartig. Typischerweise dissoziiert der Ligand bei vielen anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in dem sauren Milieu der Endosomen. Ein spät endosomaler/lysosomaler Transport von aktivierten Rezeptoren war bislang nur für die Protease-aktivierten Rezeptoren eindeutig belegt, die eine konstitutive Aktivierung aufweisen. Für den ETA wurde hingegen an CHO-Zellen oder ETB-defizienten primär kultivierten Astrozyten keine wesentliche Internalisierung von Rezeptor und Ligand in endosomale Kompartimente beobachtet. Damit konnten für ETA und ETB unterschiedliche Internalisierungswege beschrieben werden, die auch zu Unterschieden der Oberflächenexpression beider Rezeptoren führen. Darüber hinaus zeigt die über Stunden nachweisbare Kolokalisation des ETB mit ET1, daß der ETB auch als Clearance-Rezeptor fungiert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine mögliche polarisierte Oberflächenexpression des ETB an MDCK-Zellen untersucht. Für diese Zellen konnte gezeigt werden, daß der ETB gleichermaßen basolateral und apikal exprimiert wird. Ein potentielles tyrosinhaltiges basolaterales Sortiermotiv (GYXXF) ist für den Transport des Rezeptors ohne Bedeutung. Damit sind Epithelzellen sowohl von der apikalen als auch der basolateralen Seite für ET1 sensitiv. Dies trifft z.B. für Nierenepithelzellen zu, die den ETB exprimieren; da ET1 sowohl im Urin als auch Interstitium vorliegt ist eine Stimualtion der Zellen von beiden Seiten möglich. Weitere Arbeiten müssen nun klären, ob ETB auch in Endothelzellen auf apikalen (luminal) und basalen (abluminal) Plasmamembranen vorliegen. Diese Fragestellung ist von Bedeutung, da ET1 von den Endothelzellen v.a. nach basolateral sezerniert wird. Das Vorliegen basolateraler ETB würde damit auch eine autokrine/parakrine Stimulation der Endothelzellen bedeuten.Endohelins (ET1, ET2, ET3) are peptides consisting of 21 amino acids, which evolve their properties over G-protein coupled receptors: 1) particularly Endothelin A-receptors (ETA) expressed on vascular smooth muscle cells and 2) Endothelin B-receptors (ETB) on endothelial cells. ETA mediate a long lasting vasoconstriction, while ETB exhibit only a short vascular relaxation. The reason for these differences on vascular reactions among endothelin-receptor subtypes is not known at this time. Differences in internalisation and intracellular transport could be a possible reason. While ETA recycling in smooth muscle cells could be described, no analysis exist for the ETB. In this work, fluorescent ET1 and Endothelin-receptor/GFP-fusion protein was used to show, that after binding of ET1, ETB is internalised in a sucrose-sensitive, meaning clathrin-mediated pathway. The ligand remain associated in a stable complex with the receptor and is transported in late endosomes/lysosoms for degradation ("down-regulation"). These analyses on CHO-cells could also be validated on cultivated primary astrocytes. At this time the down-regulation of receptor and ligand is unique for G-protein coupled receptors. Typically in many cases ligand dissociates from G-protein coupled receptors in the acidic environment of endosomes. Only protease activated receptor, clearly show a constitutive transport in late endosoms/lysosoms. Whereas no internalisation could be observed for ETA, neither in CHO-cells nor in primary cultivated astrocytes. For this reason different internalisation pathways for ETA and ETB could be described leading to different surface expression. Furthermore colocalisation of ETB with ET1, detectable for hours, document the clearance function of ETB. In the second part of this work, a possible polarised surface expression of the ETB was analysed with MDCK-cells. For these cells it could be shown, that ETB is expressed in equal measure on apical and basolateral membrane. A potential basolateral sorting motive including tyrosin (GYXXF) has no effect on receptor transport. It can be concluded that epithelial cells are sensitive for ET1 also from basolateral side. This applies for epithelial kidney cells expressing ETB; because ET1 exist as well in urine as in interstitium, thus stimulation is possible from both sides. Further work should be done to clarify if ETB also exist in endothelial cells on apikal (luminal) and basal (abluminal) plasmamembrane. This question is important, because ET1 is released from endothelial cells mainly on basolateral side. The existence of ETB on this side, would signify an autocrine/paracrine stimulation of endothelial cells