A bilirrubina altera a mielinização no período neonatal precoce

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012Oligodendrocytes (OL) are neuroglial cells present in the central nervous system responsible for myelin sheath formation, that provide an electric insulation of axons fastening the transmission of electrical signals. During the neonatal period, the brain is particularly vulnerable to toxic insults, like the one induced by hyperbilirubinemia. It has been demonstrated that in this condition, high levels of unconjugated bilirubin (UCB) are toxic to endothelial cells, neurons, astrocytes and microglia. However, the result of oligodendrocyte precursor cell (OPC) exposure to UCB has never been explored. Thus, this thesis intended to access the vulnerability of OPC to UCB, in conditions mimicking neonatal hyperbilirubinemia, and dissect the mechanisms that might be impared through OPC maturation and neuronal myelination. First, we observed that UCB induced OPC apoptosis and necrosis-like cell death. This increase revealed to be due to early signals of endoplasmic-reticulum (ER) stress, followed by c-Jun N-terminal kinase 1/2 activation, mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species (ROS) production. Resulting changes in intracellular calcium homeostasis, led to subsequent calpain activation. In addition, when specific inhibitors of caspases, calpains and oxidative stress were used, we observed prevention in UCB-induced OPC death. We next verified, by using an in vitro OL maturation model, that UCB impaired OL differentiation, increasing the number of immature cells, involving changes in the messenger ribonucleic acid expression of Olig1 and Olig2 transcription factors. Moreover, UCB led to changes in the morphology of mature cells, decreasing the diameter and the number of primary processes, as a result of the decreased proportion of active Rac1. Using a myelinating co-culture model we were able to show that UCB induced not only similar effects in OL differentiation and maturation, but also a decrease in the myelination pattern, with consequent decrease both in the number of myelinated internodes and in internode length. These myelination-related alterations were corroborated in organotypic cerebellar slice cultures, where we also observed microgliosis and astrogliosis, increased inflammation and glutamate release upon exposure to UCB. Finally, in an animal model of severe hyperbilirubinemia we found myelin deficits and changes in astrocyte and microglia number in several brain regions, including cerebellum, medulla oblongata and pons. Interestingly, cerebellum evidenced the highest reduction in volume, together with a marked impairment in Purkinje cells. In conclusion, our findings suggest that UCB compromises oligodendrogenesis and OL ability to myelinate, thus compromising axonal function and transmission of the nerve impulse. This intervention in neurodevelopment impairment in jaundiced babies may additionally turn out an increased vulnerability to aging and/or appearance of neurological diseases.Os oligodendrócitos (OL) são células gliais existentes no sistema nervoso central dos vertebrados. Estas células são responsáveis pela formação de uma das estruturas mais especializadas nos humanos, as bainhas de mielina. Estas fornecem não apenas suporte aos axónios, mas também permitem a propagação saltatória dos impulsos nervosos nos neurónios, tornando assim bastante mais rápida a transferência de informação entre as diferentes regiões cerebrais. A progressão destas células ao longo da sua maturação envolve vários passos de diferenciação que são identificáveis de acordo com um aumento da sua complexidade morfológica, com uma diminuição da sua capacidade migratória e com o padrão de expressão de marcadores específicos. Assim, durante a maturação, os OL vão adquirindo uma morfologia cada vez mais complexa e perdem a sua capacidade migratória e proliferativa. Inicialmente os OL apresentam uma morfologia bipolar e possuem uma elevada capacidade proliferativa, sendo denominados como oligodendrócitos precursores (OPC). Posteriormente os OPC dão origem a OL mais diferenciados que apresentam uma morfologia mais complexa composta por vários processos. Nos estádios finais do seu desenvolvimento, os OL maduros são células que expressam proteínas da mielina, como a proteína básica da mielina (MBP), e que já estão em contacto com os axónios de modo a envolvê-los com as bainhas de mielina. Possívelmente devido ao seu complexo programa de diferenciação e ao seu elevado metabolismo, os OL são considerados como o tipo de células mais vulneráveis do sistema nervoso central. Para além disso, perturbações na mielinização durante o período neonatal poderão originar disfunção axonal e défices na condução dos impulsos nervosos, levando a alterações na comunicação cerebral com possíveis sequelas neurológicas a longo termo. A hiperbilirrubinémia é uma condição muito frequente durante o período neonatal que resulta de níveis elevados de bilirrubina não conjugada (BNC) em circulação. A BNC é formada pelo catabolismo do heme, sendo que nos recémnascidos cerca de 75% da sua totalidade é proveniente do catabolismo da hemoglobina. Durante o período neonatal, dada a fisiologia do recém-nascido, ocorrem diversas alterações no metabolismo da bilirrubina que levam a um aumento dos seus níveis em circulação. As consequências adversas da elevação dos níveis de BNC em circulação são várias podendo causar lesões reversíveis, que se podem tornar em irreversíveis em situações extremas de hiperbilirrubinémia, denominadas por kernicterus, nas quais se verifica deposição de BNC em determinadas regiões do sistema nervoso central. Estudos prévios conduzidos no nosso laboratório demonstraram que níveis elevados de bilirrubina, mimetizando uma hiperbilirrubinémia moderada, são suficientes para causar toxicidade in vitro em neurónios, astrócitos e microglia. Em neurónios observámos que a exposição à BNC leva a um dano oxidativo, libertação de glutamato e alterações na arborização neurítica, sendo as células imaturas as mais susceptíveis ao dano induzido pela BNC. Esta maior vulnerabilidade das células “jovens” foi igualmente observada nos astrócitos. Curiosamente, a BNC é capaz de estimular astrócitos e microglia, levando-as a secretar citocinas pro-inflamatórias como o factor de necrose tumoral (TNF)-α e a interleucina (IL)-1β. Em relação ao efeito da BNC nos OL, existe apenas um estudo que demonstra que os níveis elevados de BNC são responsáveis por um decréscimo na viabilidade dos OL maduros para o qual contribui a produção de óxido nítrico. Estudos mais antigos revelaram que a BNC ligase à MBP, sendo que foi recentemente demonstrada uma alteração da mielinização num caso de kernicterus, com perda de fibras mielinizadas na região do cerebelo. No entanto, tanto quanto sabemos, não foi até hoje avaliado o papel da BNC nos diferentes estádios de desenvolvimento dos OL, bem como na sua maturação e mielinização. Assim, numa primeira fase deste trabalho (Capítulo II) pretendeu-se avaliar o efeito da UCB na viabilidade dos OPC e elucidar as vias de sinalização envolvidas no processo de morte. Os nossos resultados demonstram que a BNC induz um aumento na morte celular dos OPC por apoptose e necrose. Neste processo de morte celular encontram-se envolvidos, numa fase inicial, sinais de stresse do retículo endoplasmático (ER), havendo uma sobrexpressão dos chaperones: proteína 78 regulada pela glucose (GRP78), enzima dependente do inositol 1α (IRE-1α) e factor activador da transcrição 6 (ATF-6). A alteração no ER leva por sua vez à activação da caspase-2 e das c-Jun N-terminal cinase 1 e 2 (JNK 1/2), juntamente com disfunção mitocondrial, caracterizada por perda de potencial da membrana e subsequente activação da caspase-9. Posteriormente observa-se uma activação das calpaínas, o que é indicador de um aumento da concentração intracelular de cálcio devido a uma desregulação da mitocôndria e do ER. A produção de espécies reactivas de oxigénio que encontrámos poderá então resultar do dano mitocondrial e dos seus efeitos secundários, que poderão estar na origem do segundo ciclo de activação de GRP78, IRE-1α, caspase-2 and JNK 1/2. Para que tivéssemos a certeza de que estas vias se encontravam envolvidas na morte dos OPC pela BNC recorreu-se à utilização de inibidores específicos das caspases, das calpaínas e do stresse oxidativo, que confirmaram ser então eficientes na prevenção da morte dos OPC pela BNC. Numa segunda fase do trabalho (Capítulo III), propusémo-nos avaliar os efeitos da BNC na maturação dos OL e na mielinização. Em relação à maturação dos OL, utilizaram-se culturas primárias de OPC onde se induziu a sua diferenciação. Verificou-se que a exposição à BNC antes do início da diferenciação leva a uma inibição da maturação destas células, resultando assim num número mais elevado de OPC e mais reduzido de OL maduros, quando comparado com células não tratadas. Para este resultado poderão contribuir certas alterações a nível dos factores de transcrição importantes para o desenvolvimento dos OL, dado que observámos uma subexpressão de Olig1 e uma sobrexpressão de Olig2, relativamente aos níveis do ácido ribonucleico mensageiro. Por outro lado, a exposição à BNC antes ou durante a diferenciação, evidenciou induzir alterações na maturação morfológica dos OL, onde as células tratadas apresentavam um diâmetro menor e uma redução do número e extensão dos processos. Foi-se então avaliar o papel da BNC na actividade de GTPases que se sabe regularem a polimerização do citoesqueleto. Neste caso, observou-se um decréscimo da fracção activa da Rac1 após os dois tipos de tratamento. Estes resultados evidenciaram que a BNC não só afecta a capacidade dos OL se diferenciarem, mas também a maturação morfológica necessária à mielinização. Posteriormente, num modelo de mielinização em co-cultura composto por OL e neurónios da raiz do gânglio dorsal, demonstrou-se que o tratamento com BNC antes do início da mielinização leva igualmente a um decréscimo na diferenciação dos OL, com consequente aumento do número de OPC. Curiosamente, ambos os tratamentos, tanto antes, como durante a mielinização, resultaram numa redução de OL mielinizantes, do número de internodos mielinizados por um único OL e do comprimento dos internodos. Deste modo se comprova que a acção nefasta da BNC, se exerce quer na diferenciação dos OL, quer na sua maturação e capacidade para mielinizar. Numa fase subsequente do trabalho (Capítulo IV), fomos estudar a influência que a presença de células gliais pode ter na resposta dos OL à BNC. Para tal, usou-se um modelo de cultura organotípica do cerebelo que tem a vantagem de manter a citoarquitectura do tecido e possibilitar as interacções entre células. Os resultados obtidos confirmaram mais uma vez que a BNC causa uma elevação do número de células mais imaturas, os OPC, em paralelo com uma diminuição da percentagem de fibras axonais mielinizadas. Entre as alterações causadas está igualmente o aumento da área ocupada pelos astrócitos e microglia nas regiões que se encontram na proximidade dos circuitos de matéria branca. Confirmando dados anteriores, relativamente aos efeitos imunoestimuladores da BNC, observámos também um aumento significativo da libertação de TNF-α e de glutamato e um decréscimo da libertação de IL-6, não se observando nenhuma alteração na libertação de IL-1β e de S100B. De salientar, contudo, que todos os efeitos observados mostraram depender do tempo de exposição à BNC, sendo as alterações mais pronunciadas sempre que usámos tratamentos mais prolongados. Aproveitando a oportunidade de podermos estudar os efeitos de uma hiperbilirrubinémia num murganho que desenvolve kernicterus nos primeiros dias de vida, cuja caracterização será brevemente publicada, decidiu-se proceder à avaliação dos efeitos produzidos na mielinização e na proporção de glia (Capítulo V). Os animais, estudados no momento do aparecimento dos sintomas de encefalopatia bilirrubínica, exibiam um decréscimo na proporção de axónios mielinizados, bem como um aumento no número de microglia e de astrócitos no cerebelo, no bulbo raquidiano e na ponte. De todas estas regiões, foi o cerebelo a que sofreu mais alterações, apresentando uma redução do volume relativamente à área cerebral e uma maior alteração no número e na morfologia das células de Purkinje. Em conclusão, os nossos estudos sugerem que a BNC compromete a oligodendrogénese e a capacidade dos OL de mielinizar, o que poderá comprometer a função axonal e a transmissão de impulsos nervosos, podendo desta forma contribuir para o dano neurológico observado em situações de hiperbilirrubinémia neonatal. Estes resultados têm implicações importantes para o esclarecimento dos mecanismos de neurotoxicidade da BNC e dos seus efeitos nefastos a longo prazo, ao mesmo tempo que propiciam o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras na prevenção da lesão neurológica pela BNC.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/43885/2008 e projetos PTDC/SAU-NEU/64385/2006, PEst-OE/SAU/UI4013/2011