The role of peripheral blood mononuclear cells in atherogenesis

Dissertação de Mestrado de Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2011. Dissertação defendida e aprovada em 13 Dezembro de 2011. Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Doenças Crónicas do INSA, Grupo de Imunologia Molecular e Celular (Dezembro 2010 – Dezembro 2011)Atherosclerosis (ATH) is recognized as a chronic inflammatory condition and it is the leading cause of cardiovascular disease. Atherogenesis is characterized by the infiltration of low density lipoprotein (LDL) through the endothelial layer, and migration of activated peripheral blood lymphocytes (PBL) and monocytes (PBMN) that contribute to a pro-inflammatory state in specific locations. However, the functional interaction between immunity and LDL metabolism is still not fully understood. One hypothesis for the etiopathogeny of ATH may be associated with an ongoing inflammatory process caused by a pro-oxidant/anti-oxidant imbalance induced by metals such as iron (Fe) or copper (Cu). Interestingly, ceruloplasmin (Cp) is a multicopper oxidase with a relevant role in Fe metabolism and oxidation of LDL, but also an acute-phase protein involved in the inflammatory process. Herein, we intended to study by flow cytometry the effect of putative pro-atherogenic immune stimuli on the expression of Cp at the surface of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and search for a putative association with LDL oxidation. Additionally, a population of Familial Hypercholesterolemia (FH) patients was used as a clinical model of ATH to clarify the physiologic interplay between inflammation, Fe/Cu and lipid metabolism at systemic level in this disease. The obtained results showed that higher cell surface expression of Cp was consistently observed in PBMN compared to PBL, in activated vs non-activated cells and in non-T cells vs T cells. Also, PBMC surface expression of Cp was differently modulated by several tested treatments. In particular, various modulators caused opposite effects on Cp expression of PBMN compared to PBL, suggesting a specific cell-type regulation for this protein. Specifically, it was observed that different sources of Fe might activate specific regulation mechanisms of Cp. Until now, due to technical limitations it was not possible to demonstrate an association between PBMC surface Cp expression and oxidation of LDL, but this issue should be addressed in future experiments. Of notice, IL-1β which was found to significantly increase PBMN surface Cp expression in vitro, was increased in serum from FH patients and positively correlated with total cholesterol and ApoB. However, the fact that no correlation was found between IL-1β and serum Cp (sCp)/oxidated LDL suggest that at systemic level, IL-1β may not be a contributing factor for oxidation of LDL by sCp. However, the role of PBMC surface Cp expression on LDL oxidation, namely in specific inflammatory states, remains to be established. In summary, the results of this study demonstrate that specific pro-atherogenic conditions are involved in the modulation of Cp expression at surface of PBMC and thus, suggest a possible a role of Cp in ATH.A aterosclerose (AT) é a principal causa de doenças cardiovasculares (DCV). Muito embora esta doença tenha sido numa primeira fase considerada como uma simples deposição de lípidos, avanços substanciais nas áreas da ciência experimental permitiram revelar o importante papel da inflamação nesta patologia. Actualmente, a AT já não é reconhecida como uma simples consequência de envelhecimento considerando os factores de risco tradicionalmente aceites no seu envolvimento, mas antes como uma doença inflamatória crónica que pode ser convertida num evento clínico agudo por ruptura de placas ateroscleróticas e consequente trombose. A formação da placa aterosclerótica (aterogénese) caracteriza-se por uma infiltração e activação precoce de monócitos e linfócitos (células mononucleares) que contribuem para um estado pró-inflamatório localizado em regiões de endotélio disfuncional. Adicionalmente, a passagem de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) através da camada endotelial e a sua oxidação constituem eventos precoces da aterogénese. Contudo, os mecanismos fisiológicos envolvidos na interacção funcional entre as células imunitárias e a oxidação das LDL não estão completamente esclarecidos. Uma hipótese para a etiopatogenia da AT poderá estar associada à existência de um processo inflamatório contínuo relacionado com stress oxidativo induzido por metais, tais como ferro (Fe) ou Cobre (Cu). A ceruloplasmina (Cp) é uma proteína de fase aguda da família das multicobre oxidases com funções importantes no metabolismo do Fe, principalmente devido à sua actividade ferroxidásica. Para além disso, esta proteína apresenta potencial pró- e anti-oxidante, actividades relevantes no contexto do stress oxidativo característico deste processo. O objectivo geral deste estudo foi investigar e caracterizar in vitro alguns dos mecanismos subjacentes à relação funcional entre inflamação, metabolismo do Fe/Cu e a homeostase lipídica, de forma a adquirir novos conhecimentos sobre a fisiopatologia da AT. Em particular, estudaram- os efeitos de status de Fe e Cu alterado, citocinas pró-inflamatórias e outros imunomoduladores na expressão de Cp à superfície de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). Este estudo foi realizado através da utilização de citometria de fluxo, que possibilitou caracterizar a expressão da Cp membranar em subpopulações leucocitárias específicas de monócitos (PBMN) e linfócitos (PBL) de sangue periférico. Posteriormente, avaliou-se a possível associação entre a modulação da expressão de Cp membranar nas condições testadas e a oxidação de LDL. Adicionalmente, realizou-se a caracterização laboratorial de uma população de doentes diagnosticados com Hipercolesterolemia Familiar (HF), como um modelo clínico de AT. Neste contexto, pretendeu-se complementar os estudos in vitro procurando a existência de associações entre os parâmetros do metabolismo do Fe/Cu, lípidos e inflamação medidos a nível sistémico. Os resultados obtidos através de citometria de fluxo mostraram consistentemente que a expressão de Cp à superfície de PBMN é maior comparativamente com PBL e que em ambas as populações as células activadas apresentam maiores níveis de expressão desta proteína que as suas homólogas não activadas. Além disso, mostrou-se que dentro das subpopulações de PBL, são as células não-T que possuem maior expressão de Cp à sua superfície em comparação com as células T. Por outro lado, os resultados obtidos através das experiências de modulação mostraram que a Cp membranar das duas populações celulares em estudo é diferentemente regulada na presença dos diversos estímulos. Em condições de status de Fe alterado foi observado que a Cp à superfície de PBMC é diferentemente regulada nos dois tipos celulares testados, e parecem existir mecanismos de regulação específicos consoante o dador de Fe utilizado. Adicionalmente, a alteração do status de Cu não produziu modificações significativas na expressão de Cp à superfície de PBMC. Estas observações não corroboraram resultados obtidos anteriormente por outros autores e devem-se provavelmente ao curto espaço de tempo de incubação que não possibilitou visualizar o efeito de variação da concentração deste metal na estabilidade da Cp. Em relação aos tratamentos com as citocinas e outros imunomodulatores observou-se de uma forma geral que a interleucina (IL)-1β, lipopolissacarídeo, e forbol 12-miristato 13-acetato induziram o aumento da expressão de Cp à superfície dos PBMN enquanto que a diminuíram nos PBL, sugerindo que a Cp membranar destas populações celulares poderá ser regulada especificamente devido às funções particulares e diferenças de cada tipo celular durante a resposta inflamatória. Os tratamentos com interferão-γ e IL-2 diminuíram a expressão de Cp à superfície de PBMN e PBL em incubações de longa duração, enquanto os tratamentos efectuados com os mediadores IL-6, IL-8, factor estimulador de colónia de macrófagos e o factor de necrose tumoral-α não resultaram variações na expressão membranar de Cp em ambos os tipos celulares. Provavelmente, a expressão de Cp à superfície de PBMC poderá ser nestes casos modulada em curtos espaços de tempo, pelo que as condições experimentais utilizadas não permitiram confirmar esta hipótese. A influência de espécies reactivas de azoto na expressão de Cp à superfície de PBMC foi igualmente testada realizando o tratamento com S-nitroso-N-acetilpenicilamina(dador de óxido nítrico), verificando-se que na presença deste tipo de condições de stress oxidativo são especificamente os PBMN que aumentam a expressão de Cp à sua superfície. Estes resultados sugerem que em estado pró-inflamatórios e de stress oxidativo a Cp expressa à superfície dos PBMN parece estar mais associado ao papel de proteína de fase aguda descrito para a forma circulante da Cp enquanto nos PBL esta proteína parece estar mais associada à regulação de status de Fe intracelular de modo a permitir a proliferação deste tipo de células após estimulação. Posteriormente, avaliou-se uma possível associação entre a indução de Cp à superfície de PBMC e oxidação das LDL no meio. Contudo, limitações técnicas impediram a confirmação desta hipótese neste trabalho. No entanto, a detecção de níveis de LDL oxidada (oxLDL) no sobrenadante de culturas em que Cp membranar de PBMN fora induzida por IL-1β, sugere a existência de potencial pró-oxidante na forma membranar de Cp. Esta observação carece contudo de confirmação após optimização de procedimento experimental utilizado. Os resultados decorrentes da caracterização clínica do grupo de indivíduos diagnosticados com HF revelaram que estes doentes apresentam diferenças nos parâmetros relacionados com o metabolismo dos lípidos, consistentes com o seu diagnóstico molecular que mostra a existência de mutações genéticas em componentes do metabolismo lipídico. Nestes doentes foram ainda encontrados valores mais elevados de ferritina, oxLDL e IL-1β comparativamente com os indivíduos saudáveis. Além disso, nos doentes HF observou-se a existência de correlações positivas entre Cp circulante (sCp) e oxLDL, concordante com potencial pró-oxidante desta proteína, e entre sCp e proteína C reactiva - duas proteínas de fase aguda presentes em processos inflamatórios envolvidos na progressão desta doença. Foi também encontrada a correlação positiva de IL-1β com níveis de colesterol total e ApoB, parâmetros associados com risco aumentado de DCV. Contudo, o facto de não ter sido observada nenhuma correlação entre os níveis de IL-1β e sCp / oxLDL nestes indivíduos sugere que a nível sistémico a IL-1β parece não contribuir para o aumento de acção pró-oxidante da sCp. No entanto não é de excluir a possibilidade de um possível papel fisiológico de Cp expressa à superfície das PBMC a nível local nas placas ateroscleróticas. Em conclusão, os resultados deste estudo demonstram que modulatores específicos de Fe/Cu e mediadores inflamatórios putativamente associados a estados pró-aterogénicos podem estar, pelo menos em parte, envolvidos na modulação da forma membranar da Cp em PBMC, sugerindo um possível papel da Cp à superfície dessas células durante a aterogénese