Development of polymeric platforms loaded with minocycline targeting bone regeneration and tissue healing

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Bone is a mineralized conjunctive tissue with an unique trauma healing capability, however satisfactory regeneration becomes more difficult with wider bone defects. In addition, pandemic aging and obesity are increasing the request of surgical procedures, which demand grafts. Moreover, infections and inflammation-based diseases as periodontitis can cause bone matrix destruction, leading to tooth loss and ultimately to the need of bone grafts for further rehabilitation. Minocycline, a tetracycline derivative antibiotic, presents non-antimicrobial effects including interactions with matrix metalloproteinase enzymes, growth factors and cytokines, resulting in anti-inflammatory activities, collagen type 1 synthesis and upregulation of Wnt signaling, preventing bone loss and increasing bone formation. In this context, we conjectured that minocycline could be applied in three different polymeric drug-delivery platforms aiming osteoinduction, anti-inflammatory and antimicrobial activity, targeting periodontal disease with chitosan nanoparticles and bone regeneration using two different polylactide (PLA) scaffolds. Nanoparticles were produced by an ionic gelation technique and presented a rounded morphology, nanometric size and positive zeta potential. In addition, nanoparticles provided a controlled release and significant improved results regarding metabolic activity of human gingival fibroblasts. Furthermore, nanoparticles were identified within membrane-bounded vesicles inside the cytosol and presented a significant downregulation of IL-1β, TNF-α, CXCL-8 and NFKB1 inflammatory genes expression. Polylactide scaffolds loaded with minocycline were produced using two techniques, solvent casting/particulate leaching containing bioglass and 3D printing containing hydroxyapatite nanoparticles. Scaffolds were treated by alkali hydrolysis and coated with collagen. Results from both scaffolds showed controlled antibiotic release, antimicrobial activity and biofilm formation inhibition against Staphylococcus aureus. Also, presented improved cellular metabolic activity and differentiation parameters using human mesenchymal stem cells. In this work, novel chitosan nanoparticles and PLA scaffolds loaded with minocycline were successfully produced and characterized. Further in vivo studies need to be assessed to corroborate the biological benefits of these materials.O tecido ósseo é um tecido conjuntivo mineralizado com uma capacidade singular de reparação, porém, uma regeneração satisfatória torna-se mais difícil em defeitos ósseos consideráveis, justificando-se nestas situações o uso de enxertos para garantir uma regeneração apropriada. Além disso, o envelhecimento pandêmico e as altas taxas de obesidade da população vêm aumentando a necessidade de procedimentos cirúrgicos em que os enxertos são necessários. Ainda, intervenções orais e maxilofaciais como a colocação de implantes, necessitam frequentemente de enxertia para alcançar uma reabilitação protética adequada, com resultados biomecânicos e estéticos apropriados. Além do que infeções e doenças inflamatórias como periodontite podem causar a destruição da matriz óssea, conduzindo a perda dentária, a qual muitas vezes necessita de enxertos prévios à reabilitação do espaço protético. O enxerto autógeno é considerado atualmente como o enxerto padrão, uma vez que possui fatores de crescimento que promovem a osteoindução, células e uma estrutura que permite a proliferação celular e a angiogénese. Porém, este tipo de enxertos apresenta uma remodelação rápida, requer uma área dadora e está associado a morbidade e riscos para os pacientes. Como alternativa, investigadores têm vindo a desenvolver enxertos sintéticos tais como estruturas tridimensionais que tentam mimetizar a composição e a estrutura natural do osso em biomateriais cerâmicos ou poliméricos. Estes ainda podem conter fatores de crescimento ou mesmo fármacos que visam alcançar elevadas concentrações locais com menores efeitos colaterais, conseguindo-se uma melhor e mais rápida substituição do biomaterial por uma nova matriz óssea. Estes novos materiais permitem ainda reduzir o tempo cirúrgico e a morbidade do paciente, uma vez que não são necessárias áreas dadoras. No âmbito da regeneração tecidual guiada, a impressão 3D tem vindo a ser explorada, pois pode controlar com precisão as características morfológicas dos materiais e ainda produzir peças baseadas em exames de imagiologia médica. Paralelamente, sistemas nanoparticulados têm mostrado um grande potencial na veiculação localizada de fármacos, sendo usados no tratamento de cancro, infeções e regeneração tecidual, trazendo vantagens como libertação controlada de fármacos e a possibilidade de serem embebidos em polímeros e géis. O diminuto tamanho dos sistemas de partículas permite a sua penetração na matriz óssea e a internalização pelas células. Outro aspeto interessante é que alguns antibióticos apresentam efeitos no metabolismo ósseo para além da sua atividade antibacteriana. Por exemplo, a minociclina, antibiótico do grupo das tetraciclinas, apresenta vários efeitos não antimicrobianos, entre os quais, inibição de enzimas metaloproteinases, interações com citocinas e fatores de crescimento, reduzindo a inflamação, prevenindo a perda óssea e aumentando a formação de matriz óssea. Além disso, infeções relacionadas com dispositivos VIII ortopédicos aumentam a incidência de osteomielite, a qual pode levar a perda do enxerto e a necrose tecidual. Neste contexto, foram projetadas três plataformas poliméricas distintas destinadas à veiculação localizada de minociclina visando a osteoindução, a atividade anti-inflamatória e antimicrobiana. Assim, as plataformas destinadas ao tratamento periodontal ou à regeneração óssea incluíram a formulação de nanopartículas de quitosano e de dois scaffolds à base de ácido poliláctico (PLA). As nanopartículas de quitosano foram idealizadas para utilização in situ em bolsas periodontais como auxiliar terapêutico, combinando a atividade do quitosano com a da minociclina, visando a prevenção da destruição dos tecidos de suporte dentários. As nanopartículas foram produzidas por uma técnica de gelificação iónica, utilizando-se um tensioativo para melhorar a eficiência de encapsulação do fármaco. Foram realizadas várias experiências para seleccionar a formulação mais adequada à prossecução dos estudos. Os melhores resultados foram alcançados com a formulação que apresentava uma proporção de quitosano e tripolifosfato de 3:1 e pH igual a 5,5, obtendo-se uma distribuição de tamanho nanométrico (372 ± 55 nm) e uma carga superficial positiva (potencial zeta igual a + 23 ± 1 mV). A libertação total do fármaco foi alcançada ao fim de 24 horas, atingindo-se concentrações iguais a 1 μg/mL nos primeiros 30 minutos e 4 μg/mL após 24 horas, ambos valores superiores à concentração mínima inibitória da maioria dos patógenos periodontais. Os ensaios celulares foram realizados utilizando fibroblastos gengivais humanos (HGFs) e foi possível observar que as nanopartículas apresentaram um aumento significativo da atividade metabólica em comparação com uma solução de minociclina de concentração idêntica. Não foram detetadas alterações na morfologia celular, área de contato e organização do citoesqueleto de actina. Ainda, foi possível observar nanopartículas internalizadas em vesículas no citosol celular por imunofluorescência usando nanopartículas fluorescentes e por imagens de microscopia eletrónica de transmissão (TEM). Este fenómeno pode resultar num aumento da concentração do fármaco intracelular, sendo importante, uma vez que os principais patógenos podem invadir células hospedeiras ficando protegidos de alguns antibióticos e das células do sistema imunitário. Relativamente às propriedades anti-inflamatórias das nanopartículas estas foram avaliadas através de PCR quantitativo, usando HGFs tratados com lipopolissacarídeos. Os resultados permitiram concluir que as nanopartículas com minociclina reduziram significativamente a expressão gênica dos genes IL-1β, TNF-α, CXCL-8 e NFKB1 em comparação com uma solução de minociclina e com nanopartículas sem fármaco, sugerindo que a encapsulação do antibiótico nas nanoparticulas de quitosano amplifica o efeito anti-inflamatório do fármaco. Paralelamente desenvolveram-se scaffolds poliméricos com derivados de PLA para veiculação localizada de minociclina, visando a regeneração de defeitos ósseos. IX Primeiramente produziram-se scaffolds através da técnica de moldagem por solvente e lixiviação de partículas. O esteroisómero poli (D,L ácido láctico) (PDLLA) foi escolhido pela melhor osteoindução e degradação mais rápida em comparação com os outros isómeros. Os scaffolds foram preparados misturando vidro bioativo e cloreto de sódio no polímero dissolvido. Após a remoção do sal, as amostras foram tratadas por hidrólise alcalina e funcionalizadas pela adsorção de minociclina e colagénio. Imagens obtidas através de microscopia eletrónica de varrimento (SEM) permitiram a observação de poros de tamanhos variados e interconexões entre estes. As partículas do vidro bioativo foram identificadas por espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDS). As interações químicas entre o antibiótico e o polímero foram evidenciadas através de espetroscopia de infra-vermelho com transformada de Fourier (FTIR-ATR) e de dispersão de raios X (XRD), o que pode explicar a não libertação do antibiótico em pH igual a 7,4. Por outro lado, a pH igual a 5, observou-se uma libertação controlada até às 72 horas. A atividade antimicrobiana dos scaffolds foi avaliada com uma estirpe de Staphylococcus aureus através do ensaio de difusão em agar, tendo-se observado um halo de inibição de diâmetro igual a 28 ± 2 mm. Os sobrenadantes obtidos por incubação dos scaffolds contendo minociclina também apresentaram atividade antimicrobiana, obtendo-se uma concentração inibitória mínima (MIC) igual a 0,0625 μg/mL. Foi ainda observada uma inibição na produção de biofilme nas amostras com antibiótico através de imagens de SEM. O efeito dos scaffolds na atividade metabólica celular foi avaliado usando osteoblastos humanos e os resultados revelaram que o tamanho da amostra influenciou a resposta celular, evidenciando a toxicidade associada á concentração do antibiótico no meio de cultura. Com pequenos pedaços, foram obtidos resultados positivos de viabilidade celular, enquanto que, com amostras maiores, houve uma importante redução na viabilidade dos osteoblastos. Outro tipo de scaffold foi produzido através de técnica de modelagem por deposição fundida e impressão tridimensional. Subsequentemente a superfície foi modificada por hidrólise alcalina. Nanopartículas de hidroxiapatite (HA), colagénio e minociclina foram adicionados por adsorção visando a biofuncionalização destes scaffolds. A análise da superfície por SEM mostrou um aumento na rugosidade superficial, uma camada de colagénio envolvendo o material e partículas de HA. A hidrólise alcalina modificou o grau de cristalização do polímero, demonstrado por XRD. Observou-se também um aumento na molhabilidade da superfície, avaliada através da determinação dos ângulos de contato em água. Os estudos de libertação do fármaco evidenciaram uma completa eluição do antibiótico até 24 horas em pH igual a 5 e a 7,4, sendo a velocidade superior a pH ácido. Os scaffolds revelaram atividade antimicrobiana contra S. aureus, originando um halo de inibição igual a 31 ± 0,4 mm de diâmetro e apresentaram uma MIC de 0,0625 μg/mL relativamente ao sobrenadante obtido por incubação dos scaffolds. A inibição da formação de biofilme foi também observada por X SEM, tendo os scaffolds com minociclina revelado uma redução considerável. Para os ensaios de citocompatibilidade foram testadas células mesequimais humanas (hMSCs) e os resultados da redução da resazurina mostraram que os scaffolds com HA e minociclina apresentaram um aumento da viabilidade celular em comparação á amostras controle. A análise microscópicas revelaram que as células proliferaram ativamente sobre os scaffolds, com uma morfologia alongada e plana e uma distribuição dispersa. Globalmente os resultados obtidos permitem concluir que é possível desenvolver diferentes estratégias para veiculação localizada de minociclina. Conclui-se que as nanopartículas de quitosano apresentam potencial como alternativa viável na aplicação terapêutica subgengival de minociclina e que os seus efeitos anti-inflamatórios e proliferativos podem complementar o tratamento de periodontite e reduzir a destruição tecidual. Por último, observou-se que a adição de minociclina e bio-cerâmicas aos scaffolds poliméricos pode ser alcançada com métodos simples de produção e que apresentaram resultados favoráveis em relação à resposta celular e à inflamação, mantendo a atividade antimicrobiana. Novos estudos precisam ser realizados para um melhor entendimento da interação destes materiais num ambiente biológico, para assegurar sua segurança numa futura aplicação biomédica.Portuguese government, Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), (Pest-UID/DTP/04138/2014). European Commission (Cost Action TD1305, IPROMEDAI): COST-STSM-TD1305-38384