Identification of genetic mutations in patients with familial central diabetes insipidus

Diabetes insipidus (DI) is associated with defects that involve the secretion and the action of hormone arginine vasopressin (AVP) resulting in the excretion of abnormally large volumes of diluted urine. The most common defect that results in disease development is the deficient secretion of the hormone AVP and the disease is referred to as central or neurohypophyseal DI. The AVP hormone is synthesized in magnocellular neurons, that originate in the supraoptic and paraventricular nuclei of the hypothalamus and are projected to neurohypophysis, and the destruction of these neurons leads to a deficiency of AVP hormone, resulting in neurohypophyseal DI. The familial form of disease represents 1% of all causes of neurohypophyseal DI and the main points of the disease are: it is associated with mutations in one allele of the AVP gene, and it is caused by postnatal development of deficient AVP secretion, proposed to result from selective degeneration of the magnocellular neurons. The aims of this thesis are: to review AVP mutations described in the scientific literature, to expand the spectrum of mutations through the analysis of additional patients with DI and to characterize the functional consequences of identified novel AVP mutations. To achieve these aims a bibliographic research was developed; genetic studies were performed to amplify and to sequence the three exons of the AVP gene in 9 patients; an expression vector containing the desired mutations was constructed by subcloning, site-directed mutagenesis and enzymatic digestion; and the functional studies were initialized by optimization of transfection and immunocytochemistry assays for WT AVP cDNA expression vector. Three mutations were identified: c.154T>C, c.289C>G and c.343G>T. The first two mutations are novel and the last mutation is already described in the scientific literature. The AVP cDNA from the expression vector was subcloned in the pVAX/lacZ vector and the mutations were inserted in the AVP cDNA by site-directed mutagenesis and enzymatic digestion. The mutated AVP cDNAs were sequenced and have been prepared to be inserted in the expression vector. The transfection and immunocytochemistry protocols have been optimized for WT AVP cDNA expression vector. This study allowed the increase in the number of mutations from 70 to 72 different mutations, although further work is necessary in order to understand the molecular mechanisms responsible for the development of the disease and to give help and information to patients affected with this disease.A diabetes insípida (DI) é uma doença rara, caracterizada principalmente pela excreção de elevados volumes de urina na forma diluída podendo, entre várias causas possíveis, ter origem num defeito genético. O desenvolvimento da doença pode dever-se a quatro causas possíveis. A mais comum deve-se a uma deficiência na secreção da hormona antidiurética arginina vasopressina (AVP), sendo referida como DI central ou neurohipofisária. Outra possível causa da doença deve-se a uma insensibilidade, por parte das células renais, aos efeitos da AVP, sendo neste caso designada como DI nefrogénica. A DI pode também dever-se a uma excessiva ingestão de líquidos, que conduz à supressão da libertação da hormona AVP, sendo referida como polidipsia primária. Por fim, um aumento do metabolismo da hormona AVP durante a gravidez pode também ser uma causa da doença, designada por DI gestacional. A hormona AVP é sintetizada nos neurónios magnocelulares. Estes têm origem no núcleo supra-óptico e para-ventricular do hipotálamo e os seus prolongamentos terminam na neurohipófise. A destruição destes neurónios resulta numa deficiência na produção da hormona, conduzindo à DI central. Esta destruição pode ter inúmeras causas, incluindo acidentes, cirurgias, doenças autoimunes, entre outras. Contudo, a doença também apresenta uma base familiar, correspondendo a 1% de todas as causas de DI central. A DI central apresenta sintomas persistentes de poliúria, polidipsia e sede, que geralmente se começam a manifestar vários meses ou anos após o nascimento. A DI central familiar apresenta duas características principais: está associada a mutações num único alelo do gene que codifica a hormona (gene AVP), apresentando assim uma transmissão autossómica dominante; e é causada por uma deficiência progressiva pós-natal na secreção da hormona AVP, que se pensa resultar da degeneração seletiva dos neurónios magnocelulares. O gene AVP é composto por 3 mil pares de bases e encontra-se localizado no braço curto do cromossoma 20. Este gene contém três exões que codificam para o péptido sinalizador, para a hormona AVP, para a neurofisina II (transportador da hormona) e ainda para um glicopéptido, conhecido como copeptina. Após sintetizados, a hormona, a neurofisina II e o glicopéptido são armazenados em vesiculas secretoras, nos terminais axonais dos neurónios, e são libertados após a ocorrência de estímulos. Após a entrada na corrente sanguínea, a hormona vai atuar a nível das células renais de modo a aumentar a sua permeabilidade para as moléculas de água, favorecendo assim a absorção de água no rim. Até à data do início deste trabalho, a doença estava associada a 70 mutações diferentes no gene AVP localizadas ao longo de todo o precursor proteico. Pensa-se que estas mutações são a causa da doença uma vez que interferem na estabilidade da cadeia de aminoácidos, alterando a sua estrutura primária. Teoricamente, mutações que afetem a conformação de proteínas secretoras resultam no desenvolvimento de patologias devido ao seu impacto na função da proteína não conseguindo alcançar o seu destino, ficando retidas no reticulo endoplasmático. Contudo, a razão dos precursores AVP mutados serem tóxicos para os neurónios produtores de AVP está ainda por esclarecer. Existem, até ao momento, três teorias que tentam explicar o mecanismo da doença. O mecanismo não tóxico defende que há uma expressão simultânea dos precursores “wild-type” e dos precursores mutados resultando numa associação de ambos. Assim, o precursor “wildtype” é alterado, uma vez que ambos ficam retidos no reticulo endoplasmático. Contudo, este mecanismo não explica a morte dos neurónios magnocelulares. O mecanismo tóxico defende que a constante acumulação de precursores com conformações alteradas pode interferir com a produção de proteínas essenciais à sobrevivência celular, resultando assim na morte neuronal. Recentemente, um novo mecanismo foi proposto para explicar a patogénese da doença. Observou-se a formação de vesiculas autofágicas, após acumulação de precursores mutados, que resultam na destruição dos retículos endoplasmáticos danificados, juntamente com os agregados proteicos. Durante este processo, se as células forem expostas a insultos metabólicos e ambientais, pode ocorrer apoptose dependente de autofagia, resultando na destruição dos neurónios magnocelulares. A DI central familiar apresenta uma natureza benigna, contudo é uma doença que apresenta uma intensa pesquiza em torno dos seus mecanismos moleculares uma vez que se trata de um modelo de interesse para o estudo de doenças neuro-endócrinas e de transmissões autossómica dominante. O presente estudo tem por objetivos fazer uma revisão das mutações descritas na literatura científica para o gene AVP, aumentar o número de mutações descritas com a análise de novos pacientes diagnosticados com DI central familiar e caracterizar as consequências funcionais das novas mutações identificadas. Para alcançar os objetivos descritos, utilizou-se a seguinte metodologia: a revisão de todas as mutações descritas até à data, através de pesquisa bibliográfica de artigos científicos; realização de estudos genéticos, baseados na amplificação por PCR e na posterior sequenciação dos três exões do gene AVP de 9 pacientes diagnosticados com DI central familiar; inserção das novas mutações num vector de expressão contendo o cDNA do gene AVP, através de técnicas de clonagem, digestão enzimática e mutagénese dirigida; e finalmente a realização de estudos funcionais, por otimização das técnicas de transfecção e imunocitoquímica com o vector de expressão AVP “wild-type”. Os resultados obtidos mostraram que as 3 famílias apresentam mutações no gene AVP. O paciente III-1, da família A, apresenta a alteração de uma timina para uma citosina na posição 154 do cDNA (c.154T>C) que origina a substituição de uma cisteína por arginina na posição 52 da proteína (p.C52R). O paciente II-1, da família B, apresenta uma alteração de citosina para guanina na posição 289 do cDNA (c.289C>G) que resulta na substituição de uma arginina por glicina, na posição 97 da proteína. O paciente II-4 da família C apresenta a alteração de uma guanina para uma timina na posição 343 do cDNA (c.343G>T) que resulta na substituição de um ácido glutâmico por um codão de terminação na posição 115 da proteína. As três mutações estão em heterozigotia e as duas mutações encontradas no exão 2 correspondem a mutações novas, enquanto a mutação presente no exão 3 já se encontra descrita na literatura. Um vector de expressão contendo o cDNA do gene AVP (pRc/RSV-AVP), foi-nos gentilmente oferecido por investigadores da área. O cDNA do gene AVP contido no vector de expressão (pRc/RSV-AVP) foi sub-clonado no vector pVAX/lacZ e, através de mutagénese dirigida, as mutações desejadas (c.154T>C e c.289C>G) foram introduzidas no cDNA. Assim, o cDNA com as mutações está pronto a ser inserido no plasmídeo de expressão. Os ensaios de transfecção e imunocitoquímica foram otimizados para o vector de expressão “wild-type”, uma vez que foi observada marcação para a neurofisina II nos prolongamentos dos neurónios após transfecção de uma linha celular neuronal (N2A) e marcação com anticorpos específicos. Com este estudo, o número de mutações descritas para o gene AVP aumentou de 70 para 72 e mais três famílias fazem parte do número total de famílias estudadas com DI central familiar. É importante continuar o desenvolvimento de estudos funcionais, de modo a obter respostas sobre os mecanismos moleculares responsáveis pelo desenvolvimento da doença uma vez que estas serão importantes não só para a DI central familiar, mas também para o esclarecimento de outras doenças que apresentem mecanismos moleculares semelhantes