Cracking the code of chikungunya virus : inhibitors as tools to explore alphavirus biology

Chikungunya virus (CHIKV) is an arbovirus spread by the Aedes sp. of mosquitoes. Chikungunya fever results in a sudden onset of a febrile disease with headache, nausea and maculopapular rash. Additionally, a large proportion of the affected individuals experience persistent arthralgia months after all other signs of the disease have vanished. Originally discovered in Tanzania in 1952, it re-emerged with a massive outbreak in several islands of the Indian Ocean in 2004 and spilled over onto the Indian sub-continent and South-east Asia. Later CHIKV invaded Southern Europe and since the last two years has ventured into the western hemisphere, causing more than 1 million suspected infections in the Caribbean islands, Central and Latin America. The explosive nature of these outbreaks has led to a tremendous strain on the public health system of many of the affected countries already burdened with the endemically circulating Dengue virus. So far, no licensed vaccines or antivirals exist to counter this virus. Besides, it is paramount to have an in-depth understanding of the replication mechanisms of this re-emerging pathogen in order to come up with novel and effective therapeutic measures. A previously characterized CHIKV replicon cell line was used to conduct a high-throughput screen of ~3000 bioactive compounds, which are in clinical use or in clinical trials against other diseases. This led to the discovery of abamectin, ivermectin and berberine as novel antivirals effective at low micromolar concentrations and having broad-spectrum anti-alphaviral activity. Deciphering the mode of action of berberine led to the discovery that CHIKV infection robustly activates the three main branches of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling extracellular signal regulated kinase (ERK), p38 MAPK and c-Jun NH2-terminal kinase (JNK). Berberine was shown to reduce this virus-induced MAPK activation and also suppressed virus-independent ERK activation. These pathways were shown to be important for CHIKV replication, as specific inhibitors of the ERK and JNK pathways significantly reduced the viral progeny release. Most importantly, berberine reduced CHIKV-induced inflammatory disease in a mouse model and is one of the few compounds reported to show in vivo efficacy. Exploring the antiviral mechanism of obatoclax, an anticancer compound previously reported to be active against different viruses, including influenza A virus and Sindbis virus, revealed the compound to be active against other alphaviruses, including SFV and CHIKV. Further characterization showed that obatoclax inhibits viral fusion by rapidly neutralizing the acidic environment of endolysosomal organelles. Additionally, characterization of escape mutants showed that a single mutation in the SFV E1 fusion protein was sufficient to confer partial resistance against obatoclax. This study has unearthed effective candidate antivirals against alphaviruses, which have served as useful tools to help us gain further insight into alphavirus biology when characterizing their modes of action.Chikungunya virus lukeutuu arboviruksiin ja leviää Aedes sukuisten hyttysten välityksellä. Chikungunya-kuumeen tyypillisimmät oireet ovat päänsärky, pahoinvointi ja ihottuma. Osalle infektion saaneista kehittyy muiden oireiden lisäksi jopa vuosia kestävä nivelkipu. Chikungunya virus löydettiin ensimmäisen kerran Tansaniasta vuonna 1952, mikä jälkeen se on levinnyt agressiivisesti ympäri maailmaa. Vuonna 2004 virus aiheutti räjähdysmäisen epidemian monilla Intian valtameren saarilla, mistä se levisi edelleen sekä Intiaan että Kaakkois-Aasiaan. Sittemmin chikungunya virus on levinnyt mm. Etelä-Eurooppaan, Karibianmeren saarille sekä Keski- ja Latinalaiseen Amerikkaan. Chikungunya-epidemioiden räjähdysmäinen luonne on rasittanut erityisesti kohdemaiden julkista terveydenhuoltojärjestelmää. Chikungunya virusta vastaan ei vielä ole olemassa lisensoituja lääkkeitä tai rokotteita. Onkin ensiarvoisen tärkeää tuntea yksityiskohtaisesti tämän viruksen kopioitumisen mekanismit, jotta tehokkaita lääkkeitä voidaan tulevaisuudessa kehittää. Tässä väitöskirjatyössä tehtiin noin 3000 bioaktiivisen yhdisteen tehoseulonta chikungunyan replikonisolulinjalla. Näiden joukosta tunnistettiin kolme potentiaalista yhdistettä (abamektiini, ivermektiini ja berberiini), jotka ovat jo klinisessä käytössä tai kliinisesti testattavana muiden tautien parantamisessa. Nämä yhdisteet ovat tehokkaita jo hyvin pieninä pitoisuuksina ja estävät laajalti alfavirusten monistumista eläinsoluissa. Berberiinin vaikutusten tutkiminen paljasti, että chikungunya infektio aktivoi soluissa erityisesti MAP-kinaasista riippuvaisia signalointireittejä. Berberiinin huomattiin vähentävän tätä viruksen aikaansaamaa MAPK aktivaatiota, sekä estävän viruksesta riippumatonta ERK aktivaatiota. Molempien signalointireittien osoitettiin olevan tärkeitä viruksen kopioitumiselle. Berberiini myös merkittävästi vähensi, yhtenä harvoista yhdisteistä, chikungunya viruksen aiheuttamia tulehdusoireita hiirissä in vivo. Obatoklaksi on syöpähoidoissa käytetty lääkeaine, mutta sen on raportoitu olevan aktiivinen myös monia viruksia, kuten influenssa A ja Sindbis viruksia vastaan. Väitöskirjatutkimuksessani osoitimme, että obatoklaksi on aktiivinen paitsi chikungunya virusta, myös toista alfavirusta, Semliki Forest virusta vastaan. Obatoklaksi estää viruksen vapautumisen endolysosomaalisista vesikkeleistä solulimaan, neutralisoimalla näiden normaalisti happamien rakenteiden pH:n. Havaitsimme myös, että mutaatio Semliki Forest viruksen lipidivaipan proteiinissa (E1) teki viruksesta osittain vastustuskykyisen obatoklaksille. Tämän väitöskirjatyön aikana löysimme ja tunnistimme potentiaalisia antiviraalisia yhdisteitä, joiden havaittiin olevan tehokkaita erityisesti alfaviruksia vastaan. Näma yhdisteet ovat paitsi potentiaalisia lääkeaineita, myös tehokkaita työkaluja tutkittaessa yksityiskohtaisesti alfavirusten biologiaa ja toimintamekanismeja