Screening Tools for the Identification of Alphavirus Inhibitors

Alphaviruses (genus Alphaviridae in the family Togaviridae) are positive-stranded RNA viruses with a nucleocapsid of eicosahedral symmetry and a lipid envelope carrying glycoprotein spikes. The viral genome is a single 11.5 - 11.8 kb RNA strand that has a 5 cap structure and 3 poly-A tail. The replication cycle in vertebrate cells involves entry into the host cells via receptor-mediated endocytosis, translation of the RNA to form the replicase proteins and successive transcription of RNAs with both polarities, production of structural proteins and packaging of the material into newly formed virions. Even though the genus includes emerging pathogens such as the Ross-River virus and Chikungunya virus, no vaccine or chemotherapy is currently available to prevent or suppress alphavirus infections in humans. Studies on alphavirus inhibitors have been scarce and mainly involved the description of broad-spectrum antiviral agents targeting host cell enzymes. Many of these agents demonstrate a narrow therapeutic window or have immunosuppressive activities, which limit their clinical use as antiviral agents. Thus far, the only clinical study on antiviral chemotherapy for alphavirus infections was conducted in 2006 using chloroquine and failed to show any benefits when compared to placebo-treated individuals. The general challenge in bioactivity screening is the need for robust, reproducible, cost-effective and biologically accurate assays for the screening of small organic molecules against the target of interest. Antiviral screening can be conducted via two basic strategies, either by phenotypic screens using general endpoints to measure virus replication or by screening for ligands against isolated target proteins validated for their relevance in virus replication. The limitation caused by the use of pathogenic viruses in screening can be overcome by the use of surrogate viruses or by the creation of replicon-containing cell lines. Replicon cell lines are generated by transfecting cells with RNA constructs encoding the viral replicase proteins, but lacking the genes for structural proteins. The constructs are typically inserted with selection markers and reporter genes and for viruses that induce a cytopathic effect, attenuating mutations may be required to achieve a stable cell line. In the current study, two antiviral screening assays were developed and used for the identification of alphavirus inhibitors. The SFV-Rluc marker virus carrying a Renilla luciferase insertion between nonstructural proteins (nsP) 3 and 4 was demonstrated to be genetically stable and similar to wild-type virus in terms of infectivity in BHK21 cell culture infections. This virus allowed for the development of a robust luminometric assay that resulted in a Z value of 0.52, and approximately 10% deviation in the normalised mid-signal. Furthermore, a replicon approach was used in the development of an antiviral assay against CHIKV. A BHK21-based cell line persistently expressing CHIKV replicase proteins with adaptive mutations in nsP2 was adopted for antiviral screening applying the fluorescent readout of enhanced green fluorescent protein (EGFP) marker under the subgenomic promoter of the replicon and activity of the Renilla luciferase produced as a fusion protein with nsP3. Z value of 0.79 and 0.74 were achieved for the fluorescent and luminescent readouts, respectively, and the normalised mid-signal showed approximately 5% deviation. Both assays were optimised for screening environment in 96-well format and validated with previously known alphavirus inhibitors. In addition to the new antiviral assays, methods for cell viability evaluation were compared and validated in automated environment to provide counter-screening methods to be combined with the antiviral assays.. The SFV-Rluc assay was used as the primary assay for the antiviral screening of 29 nucleoside analogues, 51 semisynthetic betulin-derived compounds, 124 natural compounds and 234 synthetic drug molecules. The identified hits were counter-screened in mammalian cell viability assays. The confirmed hits were further characterised in secondary assays using CPE reduction, measurement of SFV yield and CHIKV replicon assays. 3 -amino-3 -deoxyadenosine, 3,28-O-diacetylbetulin and coumarin 30 were identified as the most potent SFV inhibitors with IC50 values of 16.2 µM, 9.1 µM and 0.4 µM, respectively. The 5,7-dihydroxyflavonoids apigenin, chrysin, naringenin and silybin were found to suppress expression of the CHIKV replicon marker gene at micromolar concentrations. Among the pharmaceutical compounds, the core structure of 10H-phenothiazine was found in 6 of the 12 confirmed hit compounds and was considered a suitable building block for future antiviral studies. In conclusion, the newly developed assays were successfully used as a panel of antiviral and cell viability assays to identify alphavirus inhibitors with diverse chemical structures.Uusia keinoja hyttysten levittämiä virusinfektioita estävien lääkeaineiden etsintään Hyttysten levittämät virustaudit ovat viime vuosina nousseet uudelleen kansainväliseksi terveysriskiksi. Historiallisesti merkittävien hyttysten levittämien virustautien kuten keltakuumeen hävittämisestä huolimatta monet näistä ns. arboviruksista jatkavat leviämistään, ja ilmastonmuutos sekä väestön lisääntyvä määrä kasvattavat epidemiariskiä entisestään. Tässä väitöskirjatyössä on kehitetty laboratoriokäyttöön soveltuvia menetelmiä, joiden avulla voidaan etsiä alfavirusten (Alphaviridae) sukuun kuuluvia viruksia estäviä yhdisteitä lääkekehityksen lähtömateriaaliksi. Alfaviruksista Suomessa esiintyvä Sindbis-virus aiheuttaa vuosittain laajuudeltaan muutamasta tapauksesta noin 1 000 tapaukseen vaihtelevan epidemian. Tätä Pogostan tautina tunnettua sairautta tavataan yleisimmin Itä-Suomessa ja sen oireita ovat kuume, ihomuutokset ja osalla sairastuneista pitkäkestoinen niveltulehdus. Kansainvälisesti suurinta huolta on aiheuttanut viimeisin vuosille 2005-2007 ajoittunut Chikungunya-viruksen (CHIKV) epidemia. Tässä epidemiassa arvioitiin olleen maailmanlaajuisesti noin 6 miljoonaa tapausta, ja tyypillisten alfavirusinfektioihin liittyvien oireiden lisäksi havaittiin aiemmin epätyypillisinä pidettyjä hermostoperäisiä oireita etenkin pienillä lapsilla. Koska alfaviruksia estäviä lääkeaineita ei ole tällä hetkellä saatavilla, tavoitteena oli kehittää menetelmiä joilla tällaisia aineita voitaisiin seuloa kemiallisista yhdistekokoelmista. Väitöskirjassa on kuvattu kaksi erillistä menetelmää, joista ensin kehitetyssä käytettiin hyväksi eniten tutkittua alfavirusten heimon mallivirusta Semliki Forest virusta (SFV). Menetelmän pohjana on viruskanta, jonka perimäainekseen lisättiin valoa tuottavaa lusiferaasiproteiinia koodaava geeni. Kun miniatyrisoidussa muodossa kasvatetut isäntäsoluviljelmät infektoidaan tällä SFV-Rluc:ksi nimetyllä viruksella, viruksen jakautumiskyky viljelmässä voidaan mitata luminometrisenä signaalina eli lusiferaasin tuottaman valon määrän perusteella. Vastaavasti lisäämällä infektioliuokseen kiinnostuksen kohteena olevia yhdisteitä voidaan niiden kyky estää viruksen jakautumista havaita tuotetun valon määrän vähenemisenä. Toisessa kehitetyssä menetelmässä tuotettiin pysyvä solulinja, johon on siirretty Chikungunya-viruksen RNA-replikoni eli viruksen replikaatioproteiineja koodaavat sekvenssit. Virus käyttää näitä ns. nonstrukturaaliproteiinejaan jakautumissyklin solunsisäisissä vaiheissa, minkä vuoksi ne ovat myös kiinnostavia lääkevaikutuskohteita. Myös tähän sovellukseen lisättiin lusiferaasia koodaava sekvenssi sekä lisäksi vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP; green fluorescent protein) koodaava alue jakautumissyklin eri vaiheiden seuraamista varten, ja menetelmä sopeutettiin lääkeaineseulontaan soveltuvaan miniatyrisoituun muotoon. Molempia menetelmiä kehitettäessä keskeinen työvaihe on ollut myös toistettavuuden ja tarkkuuden määrittäminen erilaisten tilastollisten parametrien avulla sekä menetelmien validointi tunnetuilla malliyhdisteillä. Kumpaakin menetelmää käytettiin erityyppisten yhdistekokoelmien seulomiseen uusien antiviraalisten yhdisteiden löytämiseksi, ja näissä kokeissa tunnistettujen yhdisteiden selektiivisyys virusta kohtaan tutkittiin mittaamalla yhdisteiden vaikutukset myös isäntäsolujen jakautumiskykyyn. Antiviraalisesti aktiivisiksi osoittautuivat mm. koivun kaarnasta eristetyn betuliinin puolisynteettiset johdannaiset sekä flavonoidit apigeniini ja naringeniini. Lisäksi osoitettiin myös eräiden psyykenlääkkeiden omaavan alfaviruksia estäviä vaikutuksia. Tunnistetut yhdisteryhmät avaavat uusia mahdollisuuksia alfavirusten aiheuttamien sairauksien tutkimuksessa ja hoidossa. Lisäksi tunnistettujen yhdisteiden kemiallinen monimuotoisuus osoittaa kehitettyjen menetelmien käyttökelpoisuuden erityyppisten lähtömateriaalien seulonnassa