Helper component-proteinase and coat protein are involved in the molecular processes of potato virus A translation and replication

Potato virus A (PVA), a positive-strand RNA ([+]RNA) virus, belongs to the genus Potyvirus, which is the largest RNA virus group in plants. Like all (+)RNA viruses of eukaryotes, potyviruses replicate in association with cellular endomembranes, incorporating host proteins to their cellular multiplication processes. These host proteins could be potential targets for engineering resistant crops, which is why studying the molecular interactions during virus infection is important. In this study the molecular processes of PVA translation and replication were investigated. The focus was on two viral proteins involved in these processes: the viral coat protein (CP) and helper-component proteinase (HCpro). Furthermore, the protein composition of PVA replication complexes was studied. The results obtained here confirm that the viral CP is required for PVA replication and suggest that it could be involved in the formation of the viral replication complex (VRC). Moreover, we show that CP turnover is regulated by phosphorylation and targeted proteasomal degradation, involving the host proteins coat protein interacting protein (CPIP), heat-shock protein 70 (HSP70) and carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein (CHIP), an E3 ubiquitin ligase. Altogether, tight control over CP interaction with viral RNA is required for efficient PVA infection. This study also reports the discovery of PVA-induced granules (PGs). PGs are ribonucleoprotein complexes that are induced by HCpro and contain viral RNA and host proteins involved in RNA translation and processing. PG formation is counteracted by viral genome-linked protein (VPg)-assisted PVA translation, suggesting that the components of PGs are involved in the regulation of PVA translation. Moreover, we demonstrate that HCpro acts synergistically with VPg, enhancing PVA gene expression and RNA stability. The presence of argonaute 1 (AGO1) in PGs and the inability of silencing-suppression defective HCpro to induce PGs suggests that PGs may have a role in local silencing suppression. PGs often associate with VRCs, pointing to a close relationship between viral replication and HCpro-mediated functions. An affinity-purification method coupled with liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to study the protein composition of PVA replication complexes. Viral replication-associated proteins were abundantly present in the VRCs, validating the VRC purification approach. The presence of ribosomal and translation-related proteins in PVA VRCs is in line with the notion of closely coupled viral replication and translation. Moreover, the abundance of HSP70 and other chaperones in the VRCs supports their important role in PVA replication. Lastly, the proteome data has provided several interesting candidate proteins that can be studied further in relation to PVA infection.Tämän tutkimuksen kohteena oli potyvirusten ryhmään kuuluva perunavirus A. Potyvirukset muodostavat suurimman kasvien RNA-virusten ryhmän ja ne infektoivat kasveja joka puolella maailmaa. PVA-infektio voi johtaa jopa 40 prosentin satotappioihin, mutta mahdollinen yhteisinfektio eräiden muiden ryhmien virusten kanssa voi johtaa vielä mittavampiin menetyksiin. Väitöskirjatyössä tutkittiin PVA:n monistumisen molekulaarisia mekanismeja. PVA-infektio tuottaa joustavia nauhamaisia viruspartikkeleita, jotka koostuvat noin 2000 kuoriproteiinialayksiköstä. Kun infektio on tuottanut riittävän määrän kuoriproteiinia, viruspartikkeleiden tuotto alkaa ja vastaavasti viruksen genomin monistaminen loppuu. On tärkeää säädellä kuoriproteiinin määrää infektion aikana, jotta viruspartikkeleiden tuotto ei ala liian aikaisin. Osoitimme, että isännän proteiinikinaasi CK2:n katalysoima kuoriproteiinin fosforylaatio ja kolmen isäntäproteiinin avulla tapahtuva hajottaminen säätelevät kuoriproteiinin kertymistä ja PVA:n monistumista. Tutkimuksen perusteella ehdotamme, että kuoriproteiinin sitoutuminen viruksen RNA:han estää proteiinisynteesin jatkumisen ja antaa aikaa ja tilaa viruksen monistumiseen tarvittavan proteiinikompleksin muodostumiselle. PVA:n monistamiskoneisto toimii solun endoplasmakalvostosta muodostuvissa kalvorakkuloissa, jotka suojaavat viruksen RNA:ta isäntäsolun puolustusmekanismeilta ja mahdollistavat sen genomin monistamisen suojatussa ympäristössä. Puhdistimme PVA RNA:n monistamiskoneiston sisältäviä kalvorakkuloita ja tutkimme niiden proteiinisisältöä. Monia proteiinisynteesikoneiston rakenneosien puhdistuminen rakkuloiden mukana osoitti, että viruksen genomin monistaminen ja virusproteiinien tuotto ovat läheisessä yhteydessä toisiinsa. Tämä lähestymistapa paljasti monia isännän proteiineja, joilla saattaa olla tärkeitä tehtäviä viruksen monistamisessa ja joita muokkaamalla voidaan mahdollisesti parantaa kasvien viruskestävyyttä. Kasvit puolustautuvat virusinfektiota vastaan RNA:n hiljennysmekanismin avulla. RNA-hiljennys johtaa vieraan RNA:n spesifiseen hajottamiseen. Virukset tuottavat proteiineja, jotka estävät RNA-hiljennystä ja suojaavat näin viruksen geneettistä materiaalia. Osoitimme, että PVA:n RNA-hiljennystä estävä proteiini, HCpro, laukaisee pienten jyvämäisten rakenteiden muodostumisen kasvisolussa. Nämä jyväset sisältävät PVA:n HCpro-proteiinia, viruksen RNA:ta ja monia RNA-molekyylien prosessointiin osallistuvia isäntäproteiineja. Ehdotamme, että HCpro laukaisee näiden jyvärakenteiden muodostumisen estääkseen RNA-hiljennyksen ja mahdollistaakseen viruksen monistumisen