Replicase Proteins Under Scrutiny : Trans-Replication Systems to Dissect RNA Virus Replication

My doctoral thesis examines the prerequisites of replication for three positive-strand RNA viruses, Chikungunya virus (CHIKV - alphavirus), Semliki Forest virus (SFV - alphavirus) and Flock House virus (FHV - nodavirus). Chikungunya virus (CHIKV) is a mosquito-borne RNA virus that causes high fever, rashes and joint pain. Semliki Forest virus (SFV) has been extensively studied as a model to comprehend the replication strategies of alphaviruses because of its low pathogenicity. A characteristic feature of alphavirus replication is the formation of membranous invaginations termed spherules, associated with the plasma membrane. Spherules act as genome factories as they are the sites of active viral replication and release nascent viral RNA strands into the cytoplasm through a bottleneck-like structure. We created a trans-replication system specific for CHIKV that would be flexible and presents no danger to the scientist. In this system, the viral replicase proteins are expressed from a DNA plasmid while the RNA template is produced from a second plasmid, in mammalian cells. This allowed for the study of viral replication without generating infectious particles. It also enabled the visualisation of spherules and labelling of all viral replicase proteins with fluorescent or small immunological tags while preserving their function. Various mutations associated with noncytotoxic phenotypes were analysed and the results showed no correlation between the level of RNA replication and cytotoxicity. Moreover, the trans-replication system was used to elucidate that the cysteine residue of CHIKV nsP2 at position 478 is responsible for its protease activity and essential for replicase polyprotein processing. Trp479 of nsP2 also plays a vital role in RNA replication. The insect nodavirus, FHV, verges upon the properties of a ‘universal virus’ as it can replicate in a wide range of hosts. Only the replicase protein A is required for its replication. An efficient FHV trans-replication system was established in mammalian cells. The outer surface of mitochondria displayed pouch-like invaginations with a ‘neck’ structure opening towards the cytoplasm. High-level synthesis of both genomic and subgenomic RNA was detected in vitro using mitochondrial pellets isolated from transfected cells. The newly synthesized RNA was found to be of positive polarity. This system was used to investigate the capping enzyme domain of protein A, both in cells and in vitro. Mutating the most conserved amino acids of the capping domain abolished or reduced viral RNA synthesis. Surprisingly, transfection of capped RNA template did not rescue the replication activity of the mutants. FHV and alphaviruses show evolutionarily intriguing similarities in their replication complexes and RNA capping enzymes. The biological systems presented in this study offer valuable knowledge that could be exploited to understand the replication of other RNA viruses and also open up new avenues for the elucidation of key virus-host interactions.Väitöskirjani käsittelee kolmen positiivisäikeisen RNA-viruksen lisääntymistä. Nämä virukset ovat alfaviruksiin kuuluvat chikungunya virus (CHIKV) ja Semliki Forest virus (SFV) sekä nodaviruksiin kuuluva Flock House virus (FHV). CHIKV on hyttyslevitteinen virus, joka aiheuttaa kovaa kuumetta, ihottumaa ja nivelkipuja. SFV:tä on käytetty tutkimuksissa paljon malliviruksena, koska se ei aiheuta tautia ihmisille. Alfavirusten lisääntymisen aikana solukalvolle syntyy sferuleiksi kutsuttuja kalvokuroumia. Ne toimivat viruksen genomia kopioivina tehtaina, joista tuoreet RNA:t vapautuvat solun sytoplasmaan ohuen kaulamaisen rakenteen kautta. Olemme kehittäneet replikaatiosysteemeitä (ns. trans-replikaatio), jotka ovat bioturvallisia ja joustavia tutkimusvälineitä. Näissä systeemeissä viruksen lisääntymisproteiinit ilmennetään DNA-plasmidista, kun taas toinen plasmidi tuottaa kopioituvan RNA-templaatin. Soluissa ei synny infektiokykyisiä viruksia. CHIKV-systeemissä voitiin nähdä runsaasti sferuleita, ja kaikki lisääntymisproteiinit voitiin leimata eri tavoilla. Lisäksi systeemissä analysoitiin mutaatioita, jotka vähensivät viruksen haitallisia vaikutuksia solulle, mutta nämä vaikutukset eivät korreloineet lisääntymistason kanssa. Toisaalta osoitettiin vielä, että viruksen proteaasin nsP2:n aktiivinen kohta on kysteiinitähde 478. Hyönteisvirus FHV lähestyy universaalia virusta, sillä se pystyy lisääntymään monen tyyppisissä isäntäsoluissa. Vain yksi lisääntymisproteiini (nimeltään proteiini A) tarvitaan lisääntymiseen. Rakensimme tehokkaan trans-replikaatiosysteemin FHV:lle nisäkässoluissa. Solun mitokondrioiden ulkokalvolla näkyi runsaasti kalvokuroumia, joiden avonainen kaula osoitti kohti sytoplasmaa. Soluissa ja solulysaateissa havaittiin tehokas RNA:n kopioituminen. Tässä systeemissä tutkittiin proteiini A:n aktiivisuutta RNA:n capping-reaktiossa mutanttien avulla: mutaatiot estivät tai vähensivät RNA-synteesiä. FHV:llä ja alfaviruksilla on evoluution näkökulmasta mielenkiintoisia samankaltaisuuksia. Tässä työssä kehitetyt biologiset systeemit lisäävät tietoa RNA-viruksista ja siitä miten ne toimivat interaktiossa isäntänsä kanssa