Overcoming biofilm tolerance by a novel approach targeting bacterial persisters

Multi-drug tolerance is a phenomenon, in which microorganisms normally susceptible to an antimicrobial agent are able to withstand a treatment via phenotypic alteration. The tolerance is conveyed by a microbial subpopulation that is in a non-replicative and metabolically inactive state also known as persistence. Through this kind of dormancy, the subpopulation may survive an otherwise appropriate course of antimicrobials, since the majority of the drugs target cellular division or metabolism. Upon the reduction of the surrounding antimicrobial concentration the multi-drug tolerant cells - persisters - become resuscitated thus allowing repopulation. As opposed to the more widely acknowledged challenge of antimicrobial resistance, the offspring of the specialist survivor cells are genetically identical to the susceptible majority. Persisters are especially abundant in biofilms, a microbial lifestyle characterized by aggregated microcolonies that are covered in a self-produced slimy matrix known as extracellular polymeric substance (EPS). Partly owning to this protective matrix, biofilms are inherently somewhat tolerant to antimicrobial chemotherapy. Moreover, microbes confined in a biofilm are additionally protected against the components of the host immune system. Conversely, it is assumed that persisters in planktonic, i.e. freely floating state, are easily cleared out by white blood cells. Combined, the immune evasive properties of biofilms and the remarkable multi-drug tolerance of persisters give rise to recalcitrant infections that are immensely difficult to eradicate. The described phenomenon constitutes crucially to the major healthcare challenge of chronic, treatment-resistant infections. Tuberculosis, cystic fibrosis lung disorder, bacterial endocarditis and infections related to indwelling medical devices are only a few examples of such problems. Despite the need for antimicrobials with anti-persister efficacy, no such therapeutics is available and very few are being investigated - one important factor being the lack of relevant drug discovery platforms. Therefore, the aim of this study was to develop an anti-persister assay and to carry out a pilot screening of natural product derived bioactive compounds. Based on the notion that persisters are enriched in bacterial cultures that have reached the stationary phase of growth, a persister model was designed using Staphylococcus aureus ATCC 25923 as the test strain. The bacteria were grown in liquid cultures until they reached the stationary phase and subsequent experimentation was carried out to confirm the tolerant state. After the stationary phase persister model was validated, a small pilot screening of natural products was undertaken in the hope of finding novel anti-persister activity. Mitomycin C, a cytotoxic drug with an existing anti-cancer indication was assigned as the positive control compound because of its previously established anti-persister activity. Since it is common for all of the persister-related diseases that the target microorganisms reside within a protective biofilm, an additional assay based on biofilm regrowth was designed to characterize the hit compounds on a more clinically relevant platform. The persister model culture was shown to be tolerant to conventional antibiotics. The re-induction of metabolic activity by diluting into fresh medium recovered the antimicrobial susceptibility expectedly. A total of 4 compounds were identified as anti-persister hits in the pilot screening campaign. Chromomycin A3, dehydroabietic acid, mithramycin A and oleanolic acid were all able to reduce the viable bacterial count in the stationary phase persister model more than 2 logarithmic units at 100 µM. Mithramycin A was the most potent, reducing the viability over 6 log units. The model compound mitomycin C reduced the viable counts 5.49 (± 0.96) logarithmic units. Out of the 4 hits, dehydroabietic acid was selected for the biofilm relapse assay because of its favourable biocompatibility properties. It reduced regrowth for the treated biofilms by 4 logarithmic.Monilääketoleranssi (multi-drug tolerance) on ilmiö, jossa antimikrobilääkkeelle herkät mikro-organismit kykenevät sietämään lääkehoitoa fenotyyppiään muokkaamalla. Toleranssin aikaansaa jakaantumattomassa ja metabolisesti epäaktiivisessa tilassa elävä osapopulaatio. Tämänkaltaisesta horrostilan tuomasta sietokyvystä käytetään nimitystä persistenssi. Sietokykyinen osapopulaatio voi selviytyä asianmukaisesti valitusta antimikrobilääkehoidosta, sillä lääkkeiden vaikutus kohdistuu tyypillisesti juuri solunjakaantumistoimintoihin tai aineenvaihduntaan. Kun ympäröivä lääkeainepitoisuus kuurin päätyttyä laskee, nämä monilääketolerantit solut - persisterit - elpyvät uudelleen kansoittaakseen tuhoutuneen populaation. Toisin kuin paremmin tunnetussa antimikrobilääkeresistenssin ilmiössä, näiden erikoistuneiden selviytyjäsolujen jälkeläiset ovat geneettisesti identtisiä lääkkeelle herkän osapopulaation kanssa. Persisterisoluja on erityisen runsaasti biofilmeissä. Biofilmi on yhteen takertuneiden bakteerien muodostama yhdyskunta, joka tuottaa ympärilleen tyypillisen, solunulkoisten polymeerien muodostaman limakerroksen (extracellular polymeric substance, EPS). Osittain tämän suojaavan liman ansiosta biofilmit ovat itsessään melko sietokykyisiä antimikrobilääkkeille. Lisäksi biofilmissä elävät mikrobit ovat erityisen hyvin suojattuja isäntäorganismin immuunijärjestelmää vastaan. Sen sijaan planktoniset, yksittäisinä soluina irrallaan kelluvat mikrobisolut ovat helposti valkosolujen hävitettävissä. Biofilmin immunoevasiiviset ominaisuudet yhdistettynä persisterien monilääketoleranssiin mahdollistavatkin erittäin vaikeahoitoisten, kroonisten infektioiden kehittymisen. Kuvattu sietokykymekanismi kroonistuneiden, hoitoon vastaamattomien infektioiden taustalla muodostaa merkittävän terveysuhan. Tuberkuloosi, kystisen fibroosin keuhko-ongelmat, bakteeriendokardiitti ja lääkinnällisiin laitteisiin liittyvät infektiot ovat joitakin esimerkkejä tällaisista hoidollisista haasteista. Erityisesti persistereihin tepsivien antimikrobilääkkeiden huutavasta tarpeesta huolimatta yhtäkään ei ole käytettävissä ja vain harvoja tutkitaan. Soveltuvien lääkekehitysalustojen puute on yksi olennainen syy tähän uusien keksintöjen puutteeseen. Sen vuoksi tämän työn tarkoituksena onkin kehittää menetelmä persisterilääkkeiden tunnistamiseksi ja tehdä pienen mittakaavan pilottiseulonta luonnontuotteista eristetyille, bioaktiivisille yhdisteille. Persisterien on havaittu rikastuvan stationäärivaiheen bakteeriviljelmissä. Sen vuoksi persisterimallia ryhdyttiin kehittämään Staphylococcus aureus ATCC 25923 -bakteerikannalla, jota kasvatettiin nesteviljelminä staattiseen kasvuvaiheeseen saakka. Malliviljelmän lääketoleranssi tutkittiin, minkä jälkeen se altistettiin valikoiduille luonnontuotteille tarkoituksena löytää persisteribakteereihin tehoavia yhdisteitä. Positiiviseksi kontrolliksi valittiin mitomysiini C - syöpälääkkeenä käytettävä sytotoksinen yhdiste, jonka on aiemmin todettu tuhoavan myös persisteribakteereita. Koska kliinisesti merkittävät persisteri-ilmentymät tavataan juuri biofilmeissä, päätettiin lisäksi kehittää kasvun uudelleenkäynnistymistä biofilmistä mittaava menetelmä seulontalöytöjen tarkempaan kartoittamiseen hoidollisesti relevanteissa olosuhteissa. Persisterimalli havaittiin sietokykyiseksi perinteisille antibiooteille. Metabolisen aktiivisuuden uudelleenkäynnistäminen tuoreeseen ravinneliuokseen laimentamalla palautti lääkeherkkyyden odotetusti. Seulonta löysi yhteensä 4 persistereihin tehoavaa yhdistettä: kromomysiini A3, dehydroabietiinihappo, mitramysiini A ja oleanolihappo kykenivät kaikki laskemaan elävien bakteerien lukumäärää persisterimallissa yli 2 logaritmiyksikköä 100 µM pitoisuuksina. Mitramysiini A oli yhdisteistä tehokkain vähentäen bakteerilukua yli 6 yksikköä. Malliyhdiste mitomysiini C vähensi elävien bakteerien lukua vastaavasti 5.49 (± 0.96) logaritmiyksikköä. Dehydroabietiinihappo valittiin jatkotutkimukseen biofilmin uudelleenkasvukykykokeeseen sen suosiollisen toksisuusprofiilin perusteella. Se vähensi uudelleenkasvua hoidetusta biofilmistä 4 logaritmiyksikköä osoittaen siten merkittävää aktiivisuutta