Raman Spectroscopy and Surface Plasmon Resonance as Photonic Tools for Biopharmaceutical Applications

Biophotonics is an emerging area of scientific research that uses light of photons to probe biological specimens, such as tissues, cells and molecules. The field of biophotonics is broad and considerably multidisciplinary. Therefore the prerequisite for understanding biophotonics is the capability to integrate the fundamental knowledge of the physics of light with perspectives of engineering of devices and instruments used to generate, modify, and manipulate light. Also, the fundamentals of biology and medicine are essential particularly comprehension of the biochemical and cellular phenomena that occur in living systems, and how such phenomena can be scaled up to concern the physiology of organisms, for example humans. Biological pathways and processes differ in the healthy and diseased state, and that is why it is essential to develop understanding of pathophysiology and various states of disease such as cancer, neurodegenerative disease or infectious states. Consequently, solid insights into the functions of medical treatments, including biopharmaceutics, are needed. Raman and surface plasmon resonance (SPR) are both light-based technologies enabling label-free measurements with high sensitivity. The primary aim of this Thesis was to tackle the emerging hardships encountered in the fundamental biopharmaceutical research, clinical settings, or in the pharmaceutical industry by introducing applications and data analysis methods based on the cutting edge Raman and SPR technologies. These techniques represent the biophotonic cornerstones as tools for biopharmaceutical applications throughout this Thesis. The scope of this Thesis was essentially broad. First, small drug molecules were investigated with state-of-the-art time-gated Raman technology, showing that the interfering photoluminescent backgrounds can be effectively suppressed thus improving the acquired Raman data significantly. Additionally, EVs were studied with laser tweezers Raman spectroscopy (LTRS) as larger scale analytes and representatives of a highly interesting topic in the current nanomedical field. When Raman data from several different types of single EVs was examined using sophisticated data analysis, distinct subpopulations were observed, and the differences could be related to the biochemical compositions of the vesicle membranes. For the first time, the study showed the importance of measuring single EVs instead of a pool of vesicles. Multi-parametric SPR (MP-SPR) technology was harnessed to develop applications and data analysis methods for small and larger scale analytes. Hence, a new small drug molecule, spin-labeled fluorene (SLF), was investigated in the context of Alzheimer s disease (AD) particularly its potential to interfere with the detrimental amyloid peptide aggregation processes. The developed bio-functional in vitro platform in combination with rigorous data analysis and computational simulations demonstrated the capabilities of SLF when it was employed in various biomimetic aggregation schemes. Moreover, liposomes were examined with the MP-SPR as larger scale nanomedical particles for the purposes of safe and effective nanocarrier development. The administration of a liposomal nanocarrier into the blood circulation was mimicked in the designed bionanophotonic in vitro schemes. Undiluted serum was made to interact with immobilized model liposomes in dynamic flow conditions. The findings revealed that the variation in surface chemistries of the liposomes plays a role when serum essentially immune system components are interacting with the liposomes. In particular, distinct soft and hard protein coronas were observed and characterized during the interactions. Collectively, the results and findings in this Thesis underline the broad potential of biophotonics for biopharmaceutical applications. The technical improvements in instrumentation, and creativity in the application and data analysis development make the future of biophotonics bright.Biofotoniikka on kasvava tieteenala, jossa valon fotoneja käytetään biologisten kohteiden tutkimiseen. Esimerkkeinä kudokset, solut ja molekyylit. Biofotoniikka tieteenalana on huomattavan poikkitieteellinen. Valon tuottamiseksi ja muokkaamiseksi tarvitaan perustavanlaatuista tietoa fysiikasta sekä teknisiä taitoja laitteiden suunnittelemiseksi. Lisäksi biologian, ja lääketieteen perusteet ovat olennainen osa biofotoniikkaa. Erityisen tärkeää on ymmärrys biofysiikasta ja -kemiasta sekä molekyyli- ja solutason ilmiöistä, jotka tapahtuvat elävissä systeemeissä. Tämän väitöstyön tavoitteena oli kehittää biofotonisia tekniikoita, menetelmiä ja data-analytiikkaa nykyisen biofarmaseuttisen tutkimuksen haasteisiin. Olemassa olevien in vitro menetelmien, eli esimerkiksi koeputkessa tai maljassa tehtävien biologisten mallisysteemien ongelmana on usein se, että tulosten siirrettävyys kliinisiin tutkimuksiin ja lopullisiksi lääkevalmisteiksi ei ole suoraviivaista. Esimerkiksi leima-aineiden, kuten fluoresoivien tai radioaktiivisten molekyylien lisääminen tutkittaviin kohteisiin saattaa muuttaa niiden fysikaalista ja kemiallista käyttäytymistä elävässä ympäristössä. Raman-spektroskopia ja pintaplasmoniresonanssi ovat molemmat valoon perustuvia teknologioita, joilla mittauksia voidaan suorittaa ilman leima-aineita ja korkealla herkkyydellä. Molemmista teknologioista käytettiin kehityksen kärjessä olevia instrumentteja. Ne edustivat tässä työssä biofotonisia tekniikoita, joita täydennettiin perinteisillä tutkimusmetodeilla. Väitöstyössä tutkittiin aluksi pienlääkeaineita kiinteässä olomuodossaan Raman-spektroskopian avulla. Raman-spektroskopialla voidaan mitata erittäin tarkasti tutkittavien molekyylien kemiallinen rakenne. Tavallisesti Raman-tutkimusten ongelmana on kuitenkin voimakas fotoluminesenssi, joka tuottaa häiritsevän taustasignaalin ja haittaa Raman-spektrien tulkintaa. Uudella aika-portti Raman-tekniikalla pystyttiin erottelemaan Raman- ja fotoluminesenssisignaalit tehokkaasti. Tämä mahdollisti vaikeasti mitattavien lääkeaineiden Raman-spektrien mittaamisen ja tarkemman karakterisoinnin. Tutkimusten toisessa vaiheessa mitattiin ensimmäistä kertaa yksittäisiä ekstrasellulaarivesikkeleitä. Ekstrasellulaarivesikkelit ovat solujen tuottamia, kalvorakenteisia nanorakenteita, joiden läpimitta on noin 50 1000 nm. Niiden hyödyntäminen syöpädiagnostiikassa ja nanolääketieteellisinä lääkekantajina on kasvavan kiinnostuksen kohteena, mutta tutkimuksia rajoittaa vesikkeleiden biokemiallinen monimuotoisuus ja pieni koko. Mittaukset suoritettiin toisella uudentyyppisellä Raman-tekniikalla, laser-ansalla. Terveiden solujen ja syöpäsolujen tuottamien vesikkeleiden biokemiallista koostumusta arvioitiin kehitetyn monimuuttuja-analyysin keinoin ja havaittiin, että merkittävimmät erot vesikkeleiden välillä liittyivät niiden pintarakenteiden erilaisuuteen. Saaduilla tuloksilla on merkitystä vesikkeleiden funktioiden ymmärtämisessä ja niiden hyödyntämisessä nanolääketieteellisissä applikaatioissa. Väitöstutkimuksen kahdessa muussa osiossa kehitettiin pintaplasmoniresonanssiin pohjautuvia menetelmiä sekä data-analyysiä niin ikään pienlääkemolekyylien ja nanolääketieteellisten kohteiden tutkimukseen. Käytetty moderni pintaplasmoniresonanssitekniikka mahdollisti perinteisestä poikkeavan, perusteellisemman data-analyysin toteuttamisen. Ensin tarkasteltiin Alzheimerin taudin hoitoon kehitettyä uutta lääkemolekyyliä, jonka oli todettu hidastavan haitallista amyloid-peptidien yhteenliittymistä. Tutkimuksissa kehitetty bio-funktionaalinen in vitro alusta yhdessä tietokonesimulaatioiden kanssa osoitti, että tutkittu molekyyli vähensi selvästi amyloid-aggregaatiota. Analyysillä pystyttiin myös karakterisoimaan molekyylin interaktio-ominaisuuksia. Liposomit edustivat väitöstutkimuksen viimeisessä osuudessa nanolääketieteellisiä partikkeleita, joiden ominaisuuksia tutkittiin pintaplasmoniresonanssin avulla. Tällä hetkellä ainoat ihmiskäyttöön hyväksytyt nanolääkekantajat perustuvat liposomeihin. Kehitetyllä bionanofotonisella in vitro -alustalla matkittiin liposomikantajan annostelua verenkiertoon. Laimentamattoman seerumin annettiin vuorovaikuttaa sensoripinnalle immobilisoitujen liposomien kanssa dynaamisissa virtausolosuhteissa. Tulokset osoittivat, että liposomien pintakemialla on todennäköisesti vahva vaikutus siihen, miten seerumin komponentit, erityisesti immuunijärjestelmä, reagoivat annosteltuun liposomikantajaan. Havainnoilla on potentiaalista merkitystä turvallisten ja tehokkaiden lääkekantajien kehitystyössä. Yhteenvetona voidaan todeta, että biofotoniikkaa voidaan hyödyntää hyvin luovalla tavalla biofarmaseuttisiin applikaatioihin. Väitöstutkimuksen tulokset osoittavat, että kehitetyillä alustoilla ja data-analyysimenetelmillä on mahdollista parantaa nykyistä pienlääkekehitystä sekä nanolääketieteellistä tutkimusta