Studies on bacterial and host responses in Chlamydia pneumoniae persistent infection models in cell culture

Bacteria use various mechanisms such as resistance, persistence, and tolerance to survive in unfavorable conditions. Bacterial persistence is a tendency of a bacterial population to adopt a non-growing phenotype and gain the ability to survive exposure to high concentration of antibiotics while hiding from the host immune system. Persisters arise from actively replicating bacterial populations as subpopulations without significant metabolic activity that tolerate traditional antibiotic treatments. Chlamydia pneumoniae is a gram-negative intracellular human pathogen. The ability of C. pneumoniae to convert into a persistent phenotype has been related to several chronic inflammatory diseases, such as atherosclerosis and asthma. At present, antichlamydial treatments against persistent infections are not available for clinical use. Transcriptomic changes in C. pneumoniae and its host cell have been studied previously, but proteomic-level host-chlamydial interactions remain elusive. In this study different cell models were characterized and validated to investigate persistent C. pneumoniae infection and to discover novel drug treatment targets in persisters. Human THP-1 monocyte derived macrophages and A549 human respiratory epithelial cell line were used to examine host-pathogen interactions during persistent C. pneumoniae infection and effects of clinically used antibiotics and the lignans from a widely used dietary supplement Schisandra chinensis. C. pneumoniae was found to adopt a non-replicating and antibiotic tolerant persistent phenotype in THP-1 macrophages soon after inoculation. In addition to persistence, a subpopulation of actively replicating C. pneumoniae was discovered to exist among the persisters. The infection was tolerant to clinically used antichlamydial antibiotic indicating persistent phenotype. As a hallmark of productive infection, infectious progeny production was also observed in the culture, but in a lower level than in permissive host cells. C. pneumoniae infection was concluded to be mixed type, where persistent and productive phenotypes are present at the same time inside macrophages. Label-free quantitative proteome analysis and pathway analysis tools were used to identify changes in THP-1 macrophages upon C. pneumoniae infection. At 48 h post-infection, the inflammatory pathway was induced for example via NF-κB regulation by S100A8 and S100A9 calcium-binding proteins. At 72 h post-infection proinflammatory consequences of the infection were dampened and infection-induced biological processes were related to cell cycle and DNA replication, which were negatively affected by C. pneumoniae. The host macrophage cell cycle control was inhibited by the downregulation of mini chromosome maintenance (MCM) proteins MCM2-7. The relevance of such events for C. pneumoniae replication was demonstrated by the ability of a cyclin-dependent kinase (CDK) 4/6 inhibitor to promote C. pneumoniae infectious progeny production. C. pneumoniae infection was found to suppress retinoblastoma expression and the downregulation was reverted by treatment with a histone deacetylase inhibitor. Together, these findings indicate that C. pneumoniae seems to affect differentiation of host cell macrophages and indicates host cell changes associated with myeloid-derived suppressor cell phenotype. The second persistent infection model was established in the A549 epithelial cell line with beta-lactam treatment. Based on findings by inclusion count and quantitative culture/infectious progeny production, amoxicillin treatment induced persistent phenotype in clinical antibiotic levels. By microscopy, small abnormal inclusions were observed. Persistent infection also reduced the efficacy of azithromycin and doxycycline used in clinically relevant concentrations when the antibiotics were added later or at the same time with amoxicillin treatment. The third persistence model was attempted to be set up in epithelial cells as a continuous infection model. The model has been described before in literature in a different cell line. In contrast to previous reports applying another cell line, bacteria were observed inside host cells by qPCR only for four weeks post-infection. Based on our results, A549 epithelial cells do not support long lasting continuous infection of C. pneumoniae. Schisandra lignans have earlier been reported to have antichlamydial effects against actively replicating C. pneumoniae infection in vitro. The effects of S. chinensis lignans against persistent C. pneumoniae infection were studied in different models. Schisandrin C was found to reduce genome copy numbers and infectious progeny production more than the golden standard antibiotic azithromycin in THP-1 macrophages. Schisandrin did not have bactericidal effect against persistent infection, but instead it activated the resuscitation of persistent bacteria, demonstrated by induced infectious progeny production. The concomitant treatment with schisandrin and azithromycin reduced infectious progeny production and genome numbers of C. pneumoniae more than high-dose azithromycin treatment alone. In contrast to the effects in THP-1 macrophages, similar effect was not observed in the amoxicillin-induced persistence. Moreover, schisandra lignans seem to hinder azithromycin in decreasing bacterial infectious progeny production. Determining the mode of action of schisandra lignans requires further research, but lignans are known to affect mammalian cell glutathione levels. Redox activity of the compounds is suggested to be at least a part of mechanism of action. Overall, these results contribute to the available research methods for persistent C. pneumoniae infection. New findings in pathogen-host relationships may give us new possible antipersister drug targets for future investigations and results with the lignans represent a possible interactive role of redox-active supplements with antimicrobial treatments.Bakteerit käyttävät monia keinoja, kuten resistenssiä, persistenssiä ja toleranssia selviytyäkseen epäsuotuisissa olosuhteissa. Bakteeripersistenssi on bakteeripopulaation kyky omaksua jakautumaton fenotyyppi ja selviytyä altistuksesta korkeille antibioottipitoisuuksille tai piiloutua isännän immuunijärjestelmältä. Aktiivisesti jakautuvasta bakteeripopulaatiosta lähtöisin olevalla persistentillä alapopulaatiolla ei ole merkittävää metabolista aktiivisuutta ja se on tolerantti perinteisille antibioottihoidoille. Chlamydia pneumoniae on gram-negatiivinen ihmisen solunsisäinen patogeeni. Sillä on kyky muuttua persistenttiin muotoon, mikä on yhdistetty useisiin kroonisiin tulehduksellisiin sairauksiin, kuten ateroskleroosiin ja astmaan. Antiklamydiaalisia hoitoja persistenttiä infektiota vastaan ei kuitenkaan ole tällä hetkellä kliinisessä käytössä. Transkriptiotasonmuutoksia C. pneumoniae -bakteerissa ja isäntäsolussa on tutkittu aikaisemmin, mutta proteomiikkatasolla klamydian ja isäntäsolun vuorovaikutusta tunnetaan huonosti. Tässä tutkimuksessa erilaisia solumalleja validointiin C. pneumoniae -infektion tutkimiseksi ja uusien persistenssin lääkehoitojen löytämiseksi. Ihmisen THP-1 makrofagi- ja A549 epiteelisolulinjoja käytettiin isäntä-patogeenivuorovaikutuksen tutkimiseksi persistentin C. pneumoniae -infektion aikana. Kliinisesti käytettävien antibioottien ja Schisandra chinensis kasvista peräisin olevien ravintolisänä käytettävien lignaanien tehoa tutkittiin C. pneumoniae -infektiossa. C. pneumoniae -bakteerin havaittiin muuttuvaan persistenttiin ja antibiooteille toleranttiin muotoon THP-1 makrofageissa nopeasti inokuloinnin jälkeen. Persistenssin lisäksi soluissa havaittiin myös aktiivisesti jakautuva C. pneumoniae -alapopulaatio. Infektio oli tolerantti kliinisessä käytössä olevalle antibiootille viitaten persistenttiin bakteerifenotyyppiin. Aktiiviselle infektiolle tyypillisesti, soluissa havaittiin myös uusien infektiokykyisten bakteerisolujen muodostumista, mutta vähemmän kuin permissiivisissä isäntäsoluissa. C. pneumoniae -infektion pääteltiin olevan sekainfektio, jossa persistentti ja aktiivinen bakteerifenotyyppi esiintyvät samaan aikaan makrofagisoluissa. THP-1 makrofagien vasteita C. pneumoniae -infektiolle tutkittiin leima vapaan proteomiikka- ja verkkoanalyysin menetelmiä apuna käyttäen. 48 h infektion jälkeen makrofagien tulehdusvasteen havaittiin aktivoituneen. 72 h infektion jälkeen tulehdusvasteet olivat vähentyneet ja infektion vaikutus kohdistui negatiivisesti isäntäsolun solusykliin ja DNA-replikaatioon liittyviin säätelyreitteihin. Infektio vaikutti makrofagien solusyklin säätelyyn minikromosomin ylläpitoproteiinien (MCM) 2-7 välityksellä. Kyseisten proteiinien säätelyn merkitys C. pneumoniae -bakteerin kasvulle osoitettiin inhiboimalla sykliinistä riippuvaista kinaasia (CDK) 4/6. C. pneumoniae -bakteerin havaittiin myös vähentävän retinoplastoomaproteiinin määrää ja vaikutus voitiin poistaa histonideasetylaasi inhibiittorin avulla. Näiden tulosten perusteella C. pneumoniae -bakteerin pääteltiin suuntaavan isäntäsolujen erilaistumista myeloidisupressorisolujen kaltaisiksi infektion vaikutuksesta. Toinen persistentti infektiomalli kehitettiin A549 epiteelisoluissa beetalaktaami-käsittelyn avulla. Inkluusioiden määrän ja infektiokykyisten bakteerisolujen muodostumisen vähenemisen perusteella infektion havaittiin muuttuvan persistenttiin fenotyyppiin kliinisesti käytössä oleville amoksisilliinipitoisuuksille altistettaessa. Mikroskoopilla näytteissä havaittiin epämuodostuneita bakteeri-inkluusioita. Persistentti infektio myös heikensi kliinisesti käytettävien atsitromysiinin ja doksisykliinin tehoa, kun antibiootit lisättiin myöhemmin tai samaan aikaan amoksisilliinin kanssa. Kolmas persistentti solumalli pyrittiin pystyttämään epiteelisoluissa jatkuvana infektiona. Malli on aikaisemmin kuvattu kirjallisuudessa toisessa isäntäsolulinjassa. Toisin kuin aiemman kirjallisuuden mukaan, bakteeria havaittiin PCR:n avulla solujen sisältä vain neljän viikon ajan. Näiden tulosten perusteella A549 solut eivät sovellu C. pneumoniae-bakteerin jatkuvaan infektioon. S. chinensis -kasvista eristettyjen lignaanien on aikaisemmin raportoitu tehoavan aktiivisesti jakautuvaa C. pneumoniae -infektiota vastaan in vitro-malleissa. Tässä työssä S. chinensis -lignaanien tehoa persistenttiä infektiota vastaan tutkittiin erilaisissa persistentin infektion solumalleissa. Schisandriini C:n havaittiin vähentävän bakteerin genomilukujen määrää ja infektiokykyisten bakteerisolujen muodostumista enemmän THP-1 makrofageissa kuin standardiantibioottina käytetty atsitromysiini. Schisandriinilla ei ollut bakteeriosidista vaikutusta persistenttiä infektiota vastaan, mutta sen sijaan sen havaittiin aktivoivan bakteereja takaisin aktiivisempaan muotoon infektiivisten bakteerisolujen tuottamisen lisääntyessä. Samanaikaisesti annettuna schisandriini ja atsitromysiini vähensivät infektiivisten bakteerisolujen muodostumista ja klamydian genomimäärää enemmän kuin korkea annos atsitromysiiniä yksin. Toisin kuin THP-1 makrofageissa, samanlaista lignaanien vaikutusta ei havaittu amoksisilliinilla indusoidussa persistenssimallissa. S. chinensis -lignaanit enemmin heikensivät atsitromysiinin tehoa vähentää infektiivisten bakteerisolujen muodostumista. S. chinensis -lignaanien vaikutusmekanismien selvittämiseksi tarvitaan vielä lisää tutkimusta, mutta lignaanien tiedetään vaikuttavan nisäkässolujen glutationitasoihin. Yhdisteiden redox-aktiivisuus on myös mahdollisesti yksi osa vaikutusmekanismia. Kaiken kaikkiaan, tämä tutkimus tuo lisää menetelmiä persistentin C. pneumoniae -infektion tutkimiseksi. Uudet löydökset isäntä-patogeenivuorovaikutuksessa voivat tarjota mahdollisia lääkevaikutuskohtia tulevaisuuden tutkimukselle ja lignaanien havaitut vaikutukset edustavat mahdollisesti redox-aktiivisten ravintolisien yhteisvaikutusta antimikrobisten lääkehoitojen kanssa