Differential cell type-specific transcriptional regulation of the CYP1A1 gene

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) monooxygenase plays an important role in the metabolism of environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (HAHs). Oxidation of these compounds converts them to the metabolites that subsequently can be conjugated to hydrophilic endogenous entities e.g. glutathione. Derivates generated in this way are water soluble and can be excreted in bile or urine, which is a defense mechanism. Besides detoxification, metabolism by CYP1A1 may lead to deleterious effects since the highly reactive intermediate metabolites are able to react with DNA and thus cause mutagenic effects, as it is in the case of benzo(a) pyrene (B[a]P). CYP1A1 is normally not expressed or expressed at a very low level in the cells but it is inducible by many PAHs and HAHs e.g. by B[a]P or 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Transcriptional activation of the CYP1A1 gene is mediated by aryl hydrocarbon receptor (AHR), a basic-helix-loop-helix (bHLH) transcription factor. In the absence of a ligand AHR stays predominantly in the cytoplasm. Ligand binding causes translocation of AHR to the nuclear compartment, its heterodimerization with another bHLH protein, the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) and binding of the AHR/ARNT heterodimer to a DNA motif designated dioxin responsive element (DRE). This process leads to the transcriptional activation of the responsive genes containing DREs in their regulatory regions, e.g. that coding for CYP1A1. TCDD is the most potent known agonist of AHR. Since it is not metabolized by the activated enzymes, exposure to this compound leads to a persisting activation of AHR resulting in diverse toxic effects in the organism. To enlighten the molecular mechanisms that mediate the toxicity of xenobiotics like TCDD and related compounds, the AHR-dependent regulation of the CYP1A1 gene was investigated in two cell lines: human cervix carcinoma (HeLa) and mouse hepatoma (Hepa). Study of AHR activation and its consequence concerning expression of the CYP1A1 enzyme confirmed the TCDD-dependent formation of the AHR/ARNT complex on DRE leading to an increase of the CYP1A1 transcription in Hepa cells. In contrast, in HeLa cells formation of the AHR/ARNT heterodimer and binding of a protein complex containing AHR and ARNT to DRE occurred naturally in the absence of TCDD. Moreover, treatment with TCDD did not affect the AHR/ARNT dimer formation and binding of these proteins to DRE in these cells. Even though the constitutive complex on DRE exists in HeLa, transcription of the CYP1A1 gene was not increased. Furthermore, the CYP1A1 level in HeLa cells remained unchanged in the presence of TCDD suggesting repressional mechanism of the AHR complex function which may hinder the TCDD-dependent mechanisms in these cells. Similar to the native, the mouse CYP1A1-driven reporter constructs containing different regulatory elements were not inducible by TCDD in HeLa cells, which supported a presence of cell type specific trans-acting factor in HeLa cells able to repress both the native CYP1A1 and CYP1A1-driven reporter genes rather than species specific differences between CYP1A1 genes of human and rodent origin. The different regulation of the AHR-mediated transcription of CYP1A1 gene in Hepa and HeLa cells was further explored in order to elucidate two aspects of the AHR function: (I) mechanism involved in the activation of AHR in the absence of exogenous ligand and (II) factor that repress function of the exogenous ligand-independent AHR/ARNT complex. Since preliminary studies revealed that the activation of PKA causes an activation of AHR in Hepa cells in the absence of TCDD, the PKA-dependent signalling pathway was the proposed endogenous mechanism leading to the TCDD-independent activation of AHR in HeLa cells. Activation of PKA by forskolin or db-cAMP as well as inhibition of the kinase by H89 in both HeLa and Hepa cells did not lead to alterations in the AHR interaction with ARNT in the absence of TCDD and had no effect on binding of these proteins to DRE. Moreover, the modulators of PKA did not influence the CYP1A1 activity in these cells in the presence and in the absence of TCDD. Thus, an involvement of PKA in the regulation of the CYP1A1 Gen in HeLa cells was not evaluated in the course of this study. Repression of genes by transcription factors bound to their responsive elements in the absence of ligands has been described for nuclear receptors. These receptors interact with protein complex containing histone deacetylase (HDAC), enzyme responsible for the repressional effect. Thus, a participation of histone deacetylase in the transcriptional modulation of CYP1A1 gene by the constitutively DNA-bound AHR/ARNT complex was supposed. Inhibition of the HDAC activity by trichostatin A (TSA) or sodium butyrate (NaBu) led to an increase of the CYP1A1 transcription in the presence but not in the absence of TCDD in Hepa and HeLa cells. Since amount of the AHR and ARNT proteins remained unchanged upon treatment of the cells with TSA or NaBu, the transcriptional upregulation of CYP1A1 gene was not due to an increased expression of the regulatory proteins. These findings strongly suggest an involvement of HDAC in the repression of the CYP1A1 gene. Similar to the native human CYP1A1 also the mouse CYP1A1-driven reporter gene transfected into HeLa cells was repressed by histone deacetylase since the presence of TSA or NaBu led to an increase in the reporter activity. Induction of reporter gene did not require a presence of the promoter or negative regulatory regions of the CYP1A1 gene. A promoter-distal fragment containing three DREs together with surrounding sequences was sufficient to mediate the effects of the HDAC inhibitors suggesting that the AHR/ARNT binding to its specific DNA recognition site may be important for the CYP1A1 repression. Histone deacetylase is recruited to the specific genes by corepressors, proteins that bind to the transcription factors and interact with other members of the HDAC complex. Western blot analyses revealed a presence of HDAC1 and the corepressors mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) in both cell types, while the corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) was expressed exclusively in HeLa cells. Thus the high inducibility of CYP1A1 in Hepa cells may be due to the absence of NCoR in these cells in contrast to the non-responsive HeLa cells, where the presence of NCoR would support repression of the gene by histone deacetylase. This hypothesis was verified in reporter gene experiments where expression constructs coding for the particular members of the HDAC complex were cotransfected in Hepa cells together with the TCDD-inducible reporter constructs containing the CYP1A1 regulatory sequences. An overexpression of NCoR however did not decrease but instead led to a slight increase of the reporter gene activity in the cells. The expected inhibition was observed solely in the case of SMRT that slightly reduced constitutive and TCDD-induced reporter gene activity. A simultaneous expression of NCoR and SMRT shown no further effects and coexpression of HDAC1 with the two corepressors did not alter this situation. Thus, additional factors that are likely involved in the repression of CYP1A1 gene by HDAC complex remained to be identified. Taking together, characterisation of an exogenous ligand independent AHR/ARNT complex on DRE in HeLa cells that repress transcription of the CYP1A1 gene creates a model system enabling investigation of endogenous processes involved in the regulation of AHR function. This study implicates HDAC-mediated repression of CYP1A1 gene that contributes to the xenobiotic-induced expression in a tissue specific manner. Elucidation of these processes gains an insight into mechanisms leading to deleterious effects of TCDD and related compounds.Cytochrom P450 1A1 Monooxygenase spielt eine wichtige Rolle im Metabolismus von Umweltkontaminanten wie polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) oder halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoffen (HAK). Oxidation dieser Substanzen liefert Metabolite die mit hydrophilen endogenen Molekülen wie z.B. Glutathion konjugiert werden können. Diese Derivate sind wasserlöslich und können renal oder biliär ausgeschieden werden. CYP1A1 Metabolismus könnte auch schädliche Effekte verursachen, denn er führt zur Entstehung sehr reaktiver Zwischenprodukte, die mit DNA reagieren können und auf diese Weise mutagene Effekte verursachen können. Solche Effekte liegen der Benzo[a]pyren (B[a]P) Mutagenität zugrunde. Im Normalzustand ist CYP1A1 nicht oder nur sehr gering exprimiert. Viele PAK und HAK, wie z.B. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), können CYP1A1 induzieren. Transkriptionelle Aktivierung des CYP1A1 Gens wird durch den AHR (engl.: aryl hydrocarbon receptor), einem bHLH (basischer helix loop helix) Transkriptionsfaktor, vermittelt. In seiner nicht DNA bindenden Form verbleibt AHR überwiegend im Cytoplasma. Die Bindung eines Liganden bewirkt die Translokation von AHR in den Zellkern, die Heterodimerisierung mit einem weiteren bHLH Protein, ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) und Bindung des AHR/ARNT Heterodimers an das DRE (dioxin responsive element) Motiv auf der DNA. Dieser Prozess führt zu einer transkriptionellen Aktivierung der entsprechenden Gene. TCDD ist der stärkste bekannte Ligand für AHR. Weil TCDD selbst kaum von den aktivierten Enzymen verstoffwechselt wird, führt eine Exposition gegenüber der Substanz zu einer kontinuierlichen AHR-Aktivierung und diversen toxischen Effekten im Organismus. Um die molekularen Mechanismen der toxischen Effekte von TCDD und ähnlichen Substanzen aufzuklären, wurde im Rahmen dieser Arbeit die AHR-abhängige Regulierung des CYP1A1 Gens in zwei Zelllinien, HeLa (humanes Zervix Karzinom) und Hepa (murines Hepatom), untersucht. Analysen der AHR-Aktivierung und deren Konsequenzen für die Expression des CYP1A1 Gens bestätigten die TCDD-abhängige Formierung des AHR/ARNT-Komplexes an DRE, die zu einer Induktion der CYP1A1 Transkription in Hepa Zellen führt. In HeLa Zellen jedoch zeigten diese Analysen, dass die Formierung des AHR/ARNT-Komplexes an der DRE-Sequenz schon in Abwesenheit des jeweiligen exogenen Liganden stattfindet. Außerdem führte die Behandlung mit TCDD zu keiner weiteren Aktivierung von AHR zu seiner DNA-bindenden Form. Obwohl der konstitutive Komplex an DRE in HeLa Zellen existierte, war die Transkription des CYP1A1 Gens nicht erhöht. Überdies blieb der CYP1A1 Level in HeLa Zellen auch nach Zugabe von TCDD unverändert, was darauf hinweist, dass in diesen Zellen möglicherweise hemmende Mechanismen auf die TCDD-abhängigen Prozesse Einfluss haben. Ähnlich dem nativen humanem CYP1A1 Gen konnten die Reportergenkonstrukte, die die unterschiedlichen murinen CYP1A1 regulatorischen Sequenzen beinhalten, nicht in HeLa Zellen durch TCDD aktiviert werden, was eher auf eine Bedeutung von trans-aktiven Faktoren in der Wirtszelle, als auf Spezies-spezifische Unterschiede zwischen murinem und humanem CYP1A1 Genen hinweist. Die unterschiedliche Regulierung der AHR-vermittelten Transkription des CYP1A1 Gens in Hepa und HeLa Zellen wurde weiter untersucht, um zwei Aspekte der AHR Funktion aufzuklären: (I) den Mechanismus der Aktivierung von AHR in Abwesenheit von exogenen Ligand und (II) den Faktor, der die Funktion des exogenen Ligand-unabhängigen AHR/ARNT-Komplexes hemmt. Da in früheren Studien die Transformation von AHR in Abwesenheit eines Liganden und nach Aktivierung von PKA in Hepa Zellen gezeigt wurde, bestand die Vermutung, dass ein PKA-abhängiger Signalweg den endogenen Mechanismus, welcher die konstitutive Aktivierung von AHR in HeLa Zellen auslöst, steuert. Aber weder die Aktivierung von PKA durch Behandlung der Zellen mit Forskolin oder db-cAMP noch die Inhibierung der Kinase durch Behandlung mit H89 führten zu einer Änderung der AHR/ARNT Interaktion oder deren Bindung an DRE. Außerdem zeigten diese Modulatoren der PKA-Aktivität keinen Einfluss auf die CYP1A1-Aktivität sowohl in TCDD behandelten als auch in unbehandelten Zellen. Diese Beobachtungen ergaben somit keine Hinweise auf eine Beteiligung der PKA an der Regulation des CYP1A1 Gens in HeLa Zellen. Ausschalten von Genen durch DNA-bindende Transkriptionsfaktoren in Abwesenheit ihrer Liganden wurde für nukleare Rezeptoren beschrieben. Diese Rezeptoren assozieren mit einem Multiprotein Komplex, der auch die Histondeacetylase (HDAC), ein Enzym, welches die Transkription inhibiert, enthält. Deshalb sollte die Funktion von HDAC bei der Regulation des CYP1A1 Gens untersucht werden. Eine Inhibierung von HDAC durch Behandlung mit Trichostatin A (TSA) oder Natriumbutyrat (NaBu) führte zur Aktivierung der CYP1A1 Transkription in Anwesenheit aber nicht in der Abwesenheit von TCDD in Hepa und HeLa Zellen. Western-Blot Analysen der AHR und ARNT Expressionslevel in TSA und NaBu behandelten Zellen zeigten keine Änderungen der Proteinmenge beider Transkriptionsfaktoren. Aufgrund dieser Beobachtungen muss die Hochregulierung des AHR/ARNT responsiven Gens mit Vorgängen an der regulatorischen Sequenz von CYP1A1 verbunden sein und erfolgt nicht aufgrund einer erhöhten Menge an Transkriptionsfaktoren. Ähnlich wie das native humane CYP1A1 Gen wurden auch die Reportergene, die die murine CYP1A1 Sequenzen beinhalten, von HDAC gehemmt, da die Behandlung mit TSA oder NaBu zu deren Aktivierung in Zellen führte. Das Enhancer Fragment, das drei DREs zusammen mit benachbarten Sequenzen beinhaltet, genügte um die Effekte von HDAC Inhibitoren zu vermitteln. Dies deutet daraufhin, dass die Bindung von AHR/ARNT an DRE wichtig für die Hemmung vom CYP1A1 Gen sein könnte. Histondeacetylase kann spezifische Gene inhibieren durch Interaktionen mit so-genannten Corepresoren, die die Transkriptionsfaktoren binden und mit anderen Komponenten des HDAC Komplexes interagieren. Western Blot Analysen der Mitglieder des HDAC Komplexes in HeLa und in Hepa Zellen belegten die Anwesenheit von HDAC1 und den Corepressoren mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) und SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid receptor) in beiden Zelllinien, während der Corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) ausschließlich in HeLa Zellen exprimiert wird. Ein Fehlen von NCoR könnte für die starke Induzierbarkeit des CYP1A1 Gens in diesen Zellen verantwortlich sein, im Gegensatz zu HeLa Zellen, wo die Anwesenheit von NCoR die Histondeacetylase abhängige Repression unterstützt. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Reportergenkonstrukte, die die regulatorischen Sequenzen vom Maus CYP1A1 beinhalten zusammen mit Expressionskonstrukten für NCoR, HDAC1 oder SMRT in Hepa Zellen transfiziert. Eine Überexpression von NCoR jedoch senkte nicht wie erwartet sondern erhöhte sogar leicht die Reportergenaktivität in Hepa Zellen. Die erwartete Inhibierung der Luziferase-Aktivität wurde ausschließlich mit SMRT gemessen, welches sowohl die konstitutive als auch die TCDD-induzierte Reportergenaktivität schwach senkte. Eine gleichzeitige Expression von NCoR und SMRT zeigte keine weiteren Effekte und ebenfalls nicht bei gleichzeitiger Anwesenheit von HDAC1. Deswegen ist vermutlich ein zusätzlicher Faktor in die Repression des CYP1A1 Gens involviert. Die Charakterisierung eines von einem exogenen Liganden unabhängigen AHR/ARNT-Komplexes am DRE in HeLa Zellen, der die Transkription des CYP1A1 Gens hemmt, schafft ein Model für Studien von endogenen Prozessen, die in die Regulation der AHR Funktion involviert sind. Diese Arbeit zeigt die HDAC-vermitelte Repression des CYP1A1 Gens auf, die zu der gewebespezifischen, durch Xenobiotika induzierten Expression beiträgt. Die Aufklärung dieser Prozesse vermittelt eine Einsicht in die Mechanismen der schädlichen Effekte des TCDD’s und ähnlicher Substanzen