The importance of c-Abl activity for DNA damage response and genetic stability of the Bcr-Abl-negative cells

Die Einführung von Imatinib (Glivec®, Gleevec®, STI571) im August 2001 bedeutete einen entscheidenden Fortschritt in der Therapie der Chronisch Myeloischen Leukämie (CML). Der small-molecule-Inhibitor greift direkt die onkogene Bcr Abl-Tyrosinkinase an, welche als ursächliches Ereignis der Pathogenese der CML identifiziert wurde. Zwar hat sich Imatinib als Goldstandard der Primärtherapie der CML etabliert, jedoch ist nach aktuellem Forschungsstand keine Eliminierung des malignen Bcr Abl-positiven Klons durch die Imatinib-Therapie möglich, weshalb eine langfristige, möglicherweise lebenslange Imatinib-Behandlung der Patienten notwendig ist. In der Konsequenz ist es von großem Interesse, die biologischen Effekte von Imatinib auf physiologisch normale Zellen zu klären. In Vorarbeiten zu dieser Studie konnte die Arbeitsgruppe bereits zeigen, dass die Behandlung mit Imatinib in Bcr Abl-positiven Zellen zu einer Verminderung der Mutationsfrequenz nach DNA-Schädigung führt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals nachgewiesen werden, dass die Behandlung nicht-kanzerogener primärer humaner Lymphozyten (PBMC) und muriner hämatopoetischer Zelllinien (32D und BaF3) mit Imatinib die Mutationsraten nach DNA-Schädigung deutlich erhöht. Damit hat Imatinib in Bcr Abl-negativen Zellen den gegenteiligen Effekt wie in Bcr-Abl-positiven Zellen. Somit wurde belegt, dass nicht nur die Hemmung von Bcr Abl durch Imatinib, sondern in Bcr Abl-negativen Zellen auch die Hemmung einer physiologischen Zielstruktur von Imatinib eine wichtige Rolle für die genetische Stabilität spielt. Zur Untersuchung, ob der Bcr Abl-unabhängige Effekt auf eine Hemmung der c-Abl-Aktivität durch Imatinib zurückzuführen ist, wurden die Experimente zur Stress-induzierten Mutationsfrequenz an genetischen c-Abl-Modellen durchgeführt. Hierfür wurden c-Abl-knockout-MEFs (embryonale Mausfibroblasten) verwendet, welche mit einer Wildtyp-Form von c-Abl bzw. einer Kinase-defekten Variante retransfiziert wurden. Die Mutationsfrequenz nach DNA-Schädigung ist in Zellen mit Kinase-defektem c-Abl (MEF Abl-KD) im Vergleich zu den c-Abl-wt-Zellen (MEF Abl-wt) signifikant erhöht, was bedeutet, dass die c-Abl-Aktivität tatsächlich von großer Bedeutung für die Aufrecht-erhaltung der genetischen Stabilität ist. Ursächlich für eine erhöhte Mutationsfrequenz in Zellen können unterschiedliche Faktoren, wie beispielsweise eine veränderte Proliferation der Zellen, gestörte DNA-Reparaturmechanismen oder eine verzögerte Induktion von Zelltod sein, welche dazu führen, dass die DNA-Schäden nicht oder nicht korrekt repariert und an die Tochterzellen weitergegeben werden. In dieser Arbeit konnte in verschiedenen hämatopoetischen Zell¬linien gezeigt werden, dass weder die pharmakologische noch die genetische Hemmung der c-Abl-Aktivität einen Einfluss auf die Zelltod-Induktion, Teilungsraten, Teilungsfähigkeit (Cloning Efficiency) und Zellzyklusverteilung der Zellen hat. Um zu untersuchen, inwieweit Imatinib die Kinetik der DNA-Strangbruchreparatur nach Bestrahlung beeinflusst, wurden alkalische Comet-Assays durchgeführt. Zwar konnte weder auf die Induktion von Strangbrüchen, noch auf konstitutive Strangbrüche vor Bestrahlung ein Ein¬fluss von Imatinib festgestellt werden, jedoch zeigte sich eine signifikante Verzögerung der DNA-Strangbruchreparatur in Imatinib-behandelten Zellen. Diese Verzögerung konnte in hämatopoetischen Zelllinien-Modellen und in primären humanen Lymphozyten in analoger Weise sowohl nach Behandlung mit Imatinib als auch mit Dasatinib, einem Abl-Inhibitor der zweiten Generation, nachgewiesen werden. Unter Verwendung von Zelllinien-Modellen mit ver¬schiedenen c-Abl-Varianten konnte der Nachweis erbracht werden, dass dieser Effekt tatsächlich durch die Hemmung der c-Abl-Kinaseaktivität verursacht wird: Die verzögerte Strangbruchreparatur konnte in Zellen mit Kinase-defektem c-Abl (MEF Abl-KD) ebenso gezeigt werden, während die Behandlung mit Imatinib keinen Effekt auf die Reparaturkinetik von Zellen zeigte, welche eine Imatinib-resistente Variante von c-Abl (c-Abl T315I) exprimieren. Unter alkalischen Bedingungen werden im Comet-Assay sowohl Doppel- (DSB) als auch Einzelstrangbrüche (SSB) erfasst. Zur selektiven Analyse ausschließlich der DSB-Reparatur wurde der Assay daher auch unter neutralen Bedingungen durchgeführt. Verglichen mit der SSB-Induktion konnte zwar eine erwartungsgemäß deutlich geringere Induktion von DSB nach Bestrahlung festgestellt werden, jedoch zeigte Imatinib weder bei der Induktion noch bei der Reparaturkinetik der DSB einen Einfluss. Mit Hilfe zweier weiterer Methoden, der Pulsfeld-Gelelektrophorese und der Quantifizierung von gamma-H2AX, konnte bestätigt werden, dass Imatinib keine Auswirkung auf die DSB-Reparatur hat, sondern ausschließlich eine Imatinib-abhängige Beeinflussung der SSB-Reparatur verantwortlich für die verzögerte Reparaturkinetik der Zellen ist. Umfangreiche Untersuchungen der molekularen Signalwege der DNA-Schadensprozessierung zeigen, dass die Hemmung der c-Abl-Aktivität keinen Einfluss auf den ATM-Chk2-p53- oder den ATR-Chk1-Weg hat. Ein sehr frühes Ereignis in der Prozessierung der SSB-Reparatur stellt die poly-(ADP-Ribosyl)ierung von Proteinen dar. Diese Protein-Modifizierung mit langen, verzweigten poly-(ADP-Ribose)ketten (PAR) ist ein essentieller Bestandteil der SSB-Reparatur und der base excition repair (BER). Synthese und Abspaltung von PAR werden vermittelt durch die Kinasen PARP-1 (Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase-1) und PARG (Poly-(ADP-Ribose)-Glykohydrolase). Diese Aktivität wurde anhand der Quantifizierung von PAR und der Bestimmung des Anteils der Zellen, welche zu einem bestimmten Zeitpunkt PAR-positiv waren, bestimmt. Zur Untersuchung möglicher Effekte der c-Abl-Hemmung durch Imatinib auf die poly-Ribosylierung wurde zunächst eine Methode entwickelt, um PAR-Ereignisse auf Einzelzell-Ebene nachzuweisen. Hierzu wurden die Poly-Ribosereste durch einen spezifisch gegen PAR gerichteten Antikörper markiert und mittels Fluorochrom-gekoppeltem sekundären Antikörper detektiert. Die Spezifität dieser Methode konnte eindeutig nachgewiesen werden anhand des kompletten Verlusts der Bestrahlungs-induzierten Ribosylierung nach Behandlung der Zellen mit einem bekannten spezifischen PARP-Inhibitor (PJ34). Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass durch die gleichzeitige Bestimmung des DNA-Gehalts in jeder Zelle die Ribosylierungsereignisse in Abhängigkeit von der Verteilung im Zellzyklus analysiert werden können. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass Imatinib-behandelte Zellen sowohl konstitutiv als auch induziert durch gamma Strahlung deutlich stärker poly-ribosyliert sind. Außerdem führt die Bestrahlung zu einem gegebenen Zeitpunkt nur bei einem Teil der Zellen zu Poly-Ribosylierung: Eine Subpopulation von Zellen, die sich vermutlich in der Ruhephase G0 befindet, bleibt sowohl vor als auch nach Bestrahlung PAR-negativ. In der vorliegenden Arbeit wurden damit erstmals Ribosylierungsereignisse vor und nach DNA-Schädigung in Zusammenhang mit der Verteilung im Zellzyklus gezeigt und zudem deren Abhängigkeit von der Imatinib-vermittelten c-Abl-Hemmung. Die Hemmung der Kinaseaktivität von c-Abl scheint somit zu einem verzögerten Abbau von PAR zu führen, was entweder durch eine verminderte Aktivität des PARP-1-Gegenspielers PARG oder durch eine erhöhte Aktivität von PARP-1 selbst verursacht wird. Eine Störung des räumlich und zeitlich eng modulierten Auf- und Abbaus von PAR kann zu einer verlängerten Interaktion von PARP-1 mit Reparaturproteinen der SSB-Reparatur oder der BER führen, wie z. B. XRCC1 und DNA-Polymerase beta und somit die beobachtete verzögerte DNA-Schadensreparatur verursachen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit neue Erkenntnisse über den Einfluss von Imatinib auf Bcr-Abl-negative Zellen gewonnen werden. Die hier gewonnenen in vitro-Daten deuten darauf hin, dass eine lang andauernde Behandlung mit c-Abl-Inhibitoren mit einer gesteigerten Wahrscheinlichkeit sekundärer Neoplasien verbunden sein könnte. Trotz der hervorragenden Erfolge der Imatinib-Behandlung bei CML-Patienten in chronischer Phase sollte deshalb die vollständige Elimination des malignen Klons das vorrangige Ziel der Behandlung Bcr-Abl-positiver Leukämien sein.The launch of Imatinib (Glivec®, Gleevec®, STI571) in August 2001 was an important advancement in the therapy of chronic myeloid leukemia (CML). The small-molecule inhibitor directly targets the oncogenic tyrosine kinase Bcr-Abl, which has been identified as the central cause for the development of CML. Treatment with Imatinib is the gold standard in the therapy of CML. However, taking the current state of research, an elimination of the malignant Bcr Abl-positive clone cannot be achieved by treatment with Imatinib. Thus, long-term or even lifelong treatment of patients is necessary. As a consequence, it is of great interest to clarify the biological effects of Imatinib on physiologically normal cells. Previous studies of the group showed that Imatinib treatment of Bcr Abl-positive cells leads to a decreased mutation frequency following DNA damage. Within the scope of the present work, evidence for significantly enhanced mutation rates after DNA damage in non-cancerogenic primary human lymphocytes (PBMC) and murine hematopoietic cell lines (32D and BaF3) after Imatinib treatment was obtained for the first time. Thus, Imatinib treatment of Bcr Abl-negative cells shows opposite effect compared to Bcr Abl-positive cells. It was therefore proven that the Imatinib-related inhibition of Bcr Abl as well as the off-target effects in Bcr Abl-negative cells play an important role in the genetic stability. To determine whether an Imatinib-mediated inhibition of c Abl activity is responsible for effects independent of Bcr Abl, genetic c Abl models were used to assess stress-induced mutation frequency. To this, we employed c Abl-knockout-MEFs (embryonic mouse fibroblasts), which were retransfected with wild type c Abl and a kinase-deficient form, respectively. After DNA damage, there was a significant increase in mutation frequency in the kinase-deficient cells (MEF Abl-KD) when compared to the c-Abl wild type (MEF Abl-wt) cells. Consequently, c-Abl activity is of great importance for the maintenance of genetic stability. Several factors can result in an increased mutation frequency in cells. Examples include altered cell proliferation, impaired DNA repair mechanisms or a delayed induction of cell death. In the latter case, DNA damage is not adequately repaired and passed to the daughter cells. In this study, different hematopoietic cell lines were used to show that neither the pharmacological nor the genetic inhibition of c-Abl activity has an influence on induction of cell death, division rate, cloning efficiency and cell cycle distribution. To investigate how far Imatinib influences the kinetics of DNA strand break repair after irradiation, alkaline comet assays were performed. Imatinib treatment of cells had no influence on induction of strand breaks or constitutive strand breaks prior to irradiation. However, cells treated with Imatinib exhibited a significantly delayed repair of DNA strand breaks. This delay was shown in the same manner in hematopoietic cell line models and in primary human lymphocytes, which were treated with Imatinib as well as with Dasatinib, a second generation Abl-inhibitor. Cell line models with different forms of c-Abl were used to provide evidence that this effect is caused by inhibition of the c-Abl kinase activity. The delayed repair of DNA strand breaks was also seen in cells with a kinase-deficient form of c-Abl (MEF Abl KD). But treatment with Imatinib had no effect on the kinetics of DNA repair in cells that expressed an Imatinib-resistant form of c Abl (c Abl T315I). Double- (DSB) as well as single-strand breaks (SSB) are determined in an alkaline comet assay. By applying neutral conditions, this assay can be modified to exclusively analyze DSB repair. As expected, there was a significantly lower induction of DSB after irradiation when compared to the occurrence of SSB. However, Imatinib did neither influence the induction nor the kinetics of DSB repair. Both pulsed-field gel electrophoresis and the quantification of gamma-H2AX were used to confirm that Imatinib does not affect DSB repair. Rather, the delayed repair kinetics are exclusively caused by an Imatinib-dependent interference with SSB repair. Extensive investigations of the molecular signaling pathways of DNA damage repair show that inhibition of c Abl activity does not affect ATM-Chk2-p53 or ATR-Chk1 signaling. Poly(ADP-ribosyl)ation of proteins is an early event in the processing of the SSB repair. This modification of proteins by addition of long and branched poly(ADP-ribose) chains (PAR) is an essential part of the SSB repair and base excition repair (BER). Both the synthesis and the cleavage of PAR is mediated by the kinases PARP-1 (poly(ADP-ribose) polymerase-1) and PARG (poly(ADP-ribose) glycohydrolase). This activity was determined by quantification of PAR and the percentage of cells, which were PAR-positive at a certain time. Possible effects of an Imatinib-induced inhibtion of c-Abl on poly(ADP-ribosyl)ation were investigated. To this, a method for the measurement of PAR events on a single-cell level was established. Poly(ADP-ribose) residues were marked with a PAR-specific antibody and detection followed by means of a fluorochrome-conjugated secondary antibody. The specificity of the method was proven unequivocally by a complete loss of signal when a specific PARP inhibitor (PJ34) was applied prior to irradiation-induced ribosylation. The advantage of this method is that the simultaneous determination of the DNA content in every cell allows the analysis of ribosylation events in correlation with cell cycle distribution. Based on these experiments it was found that in Imatinib-treated cells both the constitutive and the irradiation-induced poly-ribosylation are significantly enhanced. Furthermore, irradiation does not result in poly-ribosylation of all cells at a certain time: A subpopulation of cells, presumably those in the G0 resting phase, remain PAR-negative before and after irradiation. Thus, a novelty of the work at hand lies in the correlation of ribosylation events and cell cycle distribution before and after DNA damage. In this context, the central role of the Imatinib-mediated inhibition of c-Abl could also be established. The inhibited kinase activity of c-Abl seems to cause a delayed degradation of PAR. This is either caused by decreased activity of the PARP-1 antagonist PARG or by increased activity of PARP-1 itself. A disturbance of the spatially and temporally tightly modulated synthesis and degradation of PAR may lead to a prolonged interaction of PARP-1 with proteins related to SSB repair or BER, e.g. XRCC1 and DNA polymerase beta, thus resulting in the observed delay in DNA damage repair. The present study provides new insights into the impact of Imatinib on Bcr Abl-negative cells. The obtained in vitro data suggest that long-term treatment with c-Abl inhibitors may be associated with an increased likelihood of secondary neoplasias. Despite the outstanding success in Imatinib treatment of CML patients in the chronic phase, the complete elimination of the malignant clone should be the primary goal of the treatment of Bcr-Abl-positive leukemias