Cellular targets of guanidino phthalocyanines

DNA is a unique biomolecule that carries genetic information. While DNA is widely considered to be double helical, important processes such as replication and transcription require single-stranded DNA intermediates. Single-stranded DNA can form a variety of secondary structures, and one important example formed by G-rich sequences is the G- quadruplex. Though these structures are kinetically and thermodynamically stable in vitro, their existence and associated functions in vivo require additional evaluation. In particular, G- quadruplexes have been proposed to be attractive anti-cancer targets due to the abundance of guanine-rich sequences in the promoter regions of many oncogenes such as c-Myc. Hurley and co-workers have proposed that small molecules capable of stabilizing G-quadruplexes in promoters are capable of decreasing oncogene expression. This hypothesis, however, has only been evaluated using small molecules that exhibit little or no G-quadruplex selectivity as compared to duplex DNA. Hence, the potential role of G-quadruplex ligands in transcriptional regulation requires further study. In this thesis, I report the utilization of cationic phthalocyanines for probing G-quadruplex structures and function in vivo. Ammonium and guanidium-modified phthalocyanines bind to G-quadruplex DNA in vitro with exceptionally high affinity (Kd 1’000-fold) as compared to duplex DNA. Upon G-quadruplex binding, guanidinium- modified phthalocyanines exhibit a dramatic increase in fluorescence intensity. This property can be utilized in cell-based imaging studies, where fluorescent staining is localized in perinuclear regions and lysozomes of living cells. In dead and fixed cells, however, staining was observed in the nucleolus due to the association of these compounds with RNA. Since direct observation of promoter (or telomeric) G-quadruplexes fluorescence staining was not feasible, the abilities of cationic phthalocyanines to interact with putative G-quadruplexes in promoters was evaluated by measuring their global impact on gene expression using microarray analyses. Ammonium-containing phthalocyanines caused statistically significant changes of 2-fold or more (p < 0.001) in the mRNA transcription of approximately 2’000 genes in B16F10 cells. Approximately 39% of these genes contain a putative G-quadruplex- forming sequence within 1’000 nucleotides of the transcription start site. This frequency does not deviate from the genome-wide % of promoters containing a puatative G-quadruplex forming sequence. Taken together, these results do not support the presence of functional G- quadruplex structures in promoter regions capable of regulating gene expression. According to microarray analyses, guanidinium-modified phthalocyanines exhibited a very limited ability to impact global gene expression in B16-F10 cells. One derivative, tetrakis- (diisopropyl-guanidino) zinc phthalocyanine “Zn-DIGP” consistently affected the transcription of only a single gene, CXCL10. qRT-PCR experiments demonstrated that Zn- DIGP-mediated overexpression of CXCL10 was both dose- and time- dependent, and ELISA experiments revealed that Zn-DIGP caused a 20-fold increase in extracellular CXCL10 protein concentrations at sub-toxic doses. Zn-DIGP is a competitive inhibitor of CXCL10- mediated CXCR-3 activation (IC50 = 4 M), and it inhibits downstream events such as CXCL10-dependent cell migration. Interestingly, Zn-DIGP binds to the G protein-coupled receptor (GPCR) CXCR3 without activating the receptor, yet is able to cause endocytosis and degradation of CXCR3. While there are few peptide antagonists known to cause internalization of GPCRs, Zn-DIGP represents, to the best of our knowledge, the first small- molecule GPCR antagonist shown to cause receptor internalization and degradation. This process is possibly responsible for Zn-DIGP-mediated CXCL10 overexpression via dysregulation of an endogenous negative feedback loop. CXCR3 antagonists are rapidly emerging as a new class of anti-cancer agents that can inhibit metastasis. The potential anti-metastatic activities of Zn-DIGP were therefore evaluated by an assay that mimics the hematogenous spread of malignant melanoma in vivo. Zn-DIGP was found to be well tolerated upon its intravenous injection into mice at 8 mg/kg and was capable of inhibiting the formation of tumor colonies in the lungs of C57BL/6 mice injected with B16F10 cells. Our results therefore provide additional evidence that CXCR3 antagonists are a new class of anti-metastatic agents. Unlike previously reported CXCR3 antagonists, however, Zn-DIGP is also a promising sensitizer for photodynamic therapy (PDT). Upon photoexcitation with red laser light (660 nm), Zn-DIGP exhibits a high quantum yield for singlet oxygen formation ( 0.46) that results in potent phototoxicity (EC50 0.16 M) in cell cultures. Zn-DIGP can therefore be developed as a multi-functional PDT agent, where light energy can be harnessed for the treatment of primary surface tumors, while simultaneously inhibiting the formation of new tumor colonies in vital organs by interfering with chemokine signaling. DNA ist ein einzigartiges Biomolekül, welches genetische Informationen speichert. Obwohl DNA üblicherweise als doppelsträngig angenommen wird, treten wichtige Prozesse wie Replikation und Transkription nur auf, wenn die DNA einzelsträngig vorliegt. Basierend auf ihrer Sequenz kann einzelsträngige DNA eine Vielzahl von Sekundärstrukturen annehmen, und eine wichige Sekundärstruktur wird G-Quadruplex genannt. Obgleich diese Strukturen in vitro kinetisch und thermodynamisch stabil sind, ihre Existenz sowie dazugehörige Funktionen in vivo benötigen weitere Nachweise. Insbesondere wurden G-Quadruplexe als attraktive Angriffspunkte für Krebstherapien vorgeschlagen aufgrund der Fülle von Guanin- reichen Sequenzen in den Promotorregionen vieler Onkogene wie beispielsweise c-Myc. Hurley et al. berichteten, dass kleine Moleküle, welche G-Quadruplex-Strukturen in Promotorregionen stabilisieren, die Expression von Onkogenen inhibieren könnten. Diese Hypothese wurde jedoch nur mit kleinen Molekülen evaluiert, welche wenig oder keine Selektivität für G-Quadruplexe gegenüber Duplex-DNA zeigten. Deshalb erfordert die potentielle Rolle von G-Quadruplex-Liganden in der Transkriptionsregulation weitere Untersuchungen. In dieser Arbeit berichte ich über die Nutzung kationischer Phthalocyanine für den Nachweis von G-Quadruplex-Strukturen und Funktionen in vivo. Ammonium- und guanidinium- modifizierte Phthalocyanine binden an G-Quadruplex-DNA in vitro mit ausserordentlich hoher Affinität (Kd 1000fach) verglichen mit Duplex-DNA. Beim Binden an G-Quadruplex-Strukturen zeigen guanidinium-modofozierte Phthalocynine einen dramatischen Anstieg der Fluoreszenzintensität. Diese Eigenschaft wurde in Zell-basierten Experimenten genutzt, in denen Fluoreszenz in perinukleären Regionen und Lysosomen lebender Zellen lokalisiert war. In toten und fixierten Zellen jedoch wurde die fluoreszente Färbung in Nukleoli beobachtet aufgrund der Assoziation dieser Verbindungen an RNA. Da eine direkte Beobachtung der Fluoreszenzfärbung von Promoter- oder Telomer-assoziierten G-Quadruplexen nicht möglich war, die Fähigkeit der Verbindungen, mit mutmasslichen G- Quadruplex-Sequenzen in Promotoren zu interagieren, wurde indirekt untersucht durch Messung ihres globalen Effekts auf Genexpression mithilfe von Mikroarray-Analysen. Ammonium-modifizierte Phthalocyanine bewirkten statistisch signifikante Veränderungen von zweifach oder mehr (p < 0.001) der mRNA-Transkription von über 2000 Genen in B16F10-Zellen. Etwa 39 % dieser Gene enthielten mutmassliche G-Quadruplex-formende Sequenzen innerhalb von 1000 Nukleotiden ausgehend von der Transkriptions-Startstelle. Dieser Wert weicht nicht ab vom Genom-weiten Vorkommen von Promotoren mit G-reichen Sequenzen. Zusammenfassend geben diese Ergebnisse keinen Hinweis auf das Vorkommen von funktionellen G-Quadruplex-Strukturen in den Promoterregionen, welche die Genexpression regulieren können. Gemäss der Mikroarray-Analysen zeigten guanidinium-modifizierte Phthalocyanine eine sehr beschränkte Fähigkeit, die globale Genexpression in B16F10-Zellen zu beeinflussen. Ein Derivat, tetrakis-(diisopropyl-guanidino) zinc phthalocyanine „Zn-DIGP” beeinflusste die Transkription nur eines einzigen Gens konstant, CXCL10. qRT-PCR-Experimente zeigten, dass Zn-DIGP-vermittelte Überexpression von CXCL10 sowohl Dosis- als auch Zeit- abhängig war, und ELISA-Experimente offenbarten, dass nicht-toxische Mengen von Zn- DIGP einen 20fachen Anstieg der extrazellulären CXCL10-Proteinkonzentration in B16F10- Zellen bewirkten. Zn-DIGP ist ein kompetitiver Inhibitor der CXCL10-vermittelten CXCR3- Aktivierung (IC50 = 4 mM), und es inhibiert nachfolgende Prozesse wie beispielsweise CXCL10-abhängige Zellmigration. Interessanterweise bindet Zn-DIGP an den G-Protein- gekoppelten Rezeptor (GPCR) CXCR3, ohne diesen zu aktivieren, doch es ist in der Lage, Endozytose und Abbau von CXCR3 zu bewirken. Während nur wenige Peptid-Antagonisten bekannt sind, welche Internalisierung von GPCRs verursachen, repräsentiert Zn-DIGP nach unserem besten Wissen den ersten GPCR-Antagonisten auf Grundlage eines kleinen Moleküls, welcher Rezeptorinternalisierung und Abbau bewirkt. Dieser Vorgang ist möglicherweise verantwortlich für die Überexpression von CXCL10 durch eine endogene negative Feedback-Schleife. CXCR3-Antagonisten treten immer mehr als eine neue Klasse von Antikrebsmitteln hervor, welche Metastasenbildung verhindern können. Die potentielle Metastasen-inhibierende Aktivität von Zn-DIGP wurde deshalb durch einen Test evaluiert, bei welchem die hämatogene Ausbreitung von bösartigen Melanomen in vivo nachgeahmt wird. Es zeigte sich, dass Zn-DIGP bei intravenöser Injektion in Mäusen (8 mg/kg) gut toleriert wurde, und es war in der Lage, die Bildung von Tumoren in der Lunge von C57BL/6-Mäusen, welchen B16F10-Zellen injiziert worden waren, zu verhindern. Unsere Ergebnisse bieten deshalb einen zusätzlichen Hinweis, dass CXCR3-Antagonisten eine neue Klasse von Antikrebsmitteln darstellen. Anders als frühere CXCR3-Antagonisten ist Zn-DIGP jedoch auch ein vielversprechender Sensibilisator für photodynamische Therapien (PDT). Der Anregung mit rotem Laserlicht (660 nm) folgend weist Zn-DIGP eine hohe Quantenausbeute für die Generierung von Singlett-Sauerstoff auf (0.46), welcher eine potente Phototoxizität (EC50 0.16 M) in Zellkultur zur Folge hat. Zn-DIGP kann deshalb zu einem multifunktionellen PDT-Agens weiterentwickelt werden, welches mithilfe von Lichtenergie für die Behandlung von primären Oberflächentumoren benutzt werden kann, während es gleichzeitig die Bildung von neuen Tumorkolonien in lebenswichtigen Organen verhindert, indem es Chemokin-vermittelte Signalwege beeinflusst