Funcionalização de polímeros de origem proteica para a criação de biomateriais avançados

Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental - Especialidade em Biotecnologia MolecularRecombinant DNA technology has enabled us to create and produce new genetic (re)combinations otherwise not found in natural proteins or peptides. Recombinant protein-based polymers (rPBPs) arise from this technology as a class of biopolymers based on repetitive blocks of amino acid residues commonly found in structural proteins, such as the VPGVG block from mammalian elastin and the GAGAGS block from silk fibroin. The main objective of this thesis was focused on developing, production and processing of rPBPs, targeting its biomedical application. Antimicrobial Peptides (AMPs) are natural alternatives to common antibiotics which can act as antimicrobial domain when fused with a rPBP sequence. In this work genetic sequences of rPBPs were recombined with different AMPs sequences originating a set of materials in whose physicochemical and biological properties were analysed. Chapter I presents a comprehensive review on the state of the art of AMPs classification, structure and mode of action. A review on the use of AMPs for the creation of antimicrobial polymers is also presented. With respect to the rPBPs, the literature review was mainly focused on elastin-like recombinamers (ELRs) and silk-elastin-like proteins (SELPs). The experimental approaches on the functionalization of ELRs using different AMPs, as well as the material´s characterization are described in chapters II to VI. Chapters VII to IX are focused on the production of the recombinant co-polymer SELP-59-A and the material´s characterization by exploiting distinct processing methods. Chapter II describes the creation, recombinant protein production and nonchromatographic purification of a functional polymer based on the ELR A200 and the ABP-CM4 peptide, originating the new polymer termed CM4-A200. The purified material when processed into free-standing films displayed high antimicrobial activity against bacteria and fungi. The films demonstrated non-cytotoxic effects against human skin cell lines. Furthermore, they remained stable in dry and wet conditions for a wide range of temperatures, without the use of any crosslinking agent. The developed ex vivo protocol using pig skin for antimicrobial testing confirmed the antimicrobial capability of CM4-A200 films for skin applications. In chapter III is presented the work performed with CM4-A200 polymer processed by electrospinning. The fibre mats were characterized and compared to the cast films described in chapter II. Similarly to the films, the fibres retained the antimicrobial activity and revealed no cytotoxic effects. The stability of the material in wet conditions was only maintained at temperatures above 30 ºC, however the fibre mats were more resistant to thermal degradation than the cast films. Structure prediction of the ABP-CM4 peptide and genetic sequence modifications of CM4-A200 construction are presented in chapter IV. In this regard, the antimicrobial activity of the new peptides and polymers suffered no improvements. The processing procedure of the CM4-A200 polymer was modified originating nanotube patterned films, a modification that increases the contact surface area with the microbial cells. As a result, the antimicrobial activity of the CM4-A200 polymer against Staphylococcus aureus was improved. In chapter V the results on the modification of the peptide BMAP-28 sequence and further functionalization of A200 polymer are presented. When processed in cast films the BMAP-18A200 polymer presented high antimicrobial activity against bacteria, yeasts and filamentous fungi. The deletion of the last 10 amino acid residues of BMAP- 28 sequence was essential to achieve the production of the functional polymer based on this peptide. In chapter VI the peptide Hepcidin was utilized to functionalize the A200 polymer creating a highly antibacterial material in the soluble form, a feature not found in the materials described in preceding chapters. Chapter VII describes the production optimization of the recombinant polymer SELP- 59-A in Escherichia coli which resulted in the volumetric productivity of 0.5 g/L. The one-factor-a-time optimization allowed a 2.5-fold improvement over the previous described values. In the two following chapters, distinct techniques were explored to process rPBPs. In chapter VIII, SELP-59-A and SELP-1020-A were processed by electrospinning. The electrospun mats presented size-dependence on the solvent type and polymer concentration and good compatibility for skin cell line proliferation. This study was further extended to solvent-cast films of SELP-59-A, as presented in chapter IX. The films were stable at temperatures until 220 ºC and displayed electric insulating properties. Methanol treatment induced improvement of the mechanical properties and introduction of glycerol as plasticizer improved flexibility of the material. In the final chapter (X) a general discussion of the results described in the precedent chapters is presented as well as the insights on future perspectives. Overall, this thesis provides new insights on the functionalization of rPBPs, the improvement of the biological production and purification procedures, as well as on the application of distinct processing methods. The rPBPs that were created will certainly contribute to fulfil the demand of new antimicrobial materials in particular for advanced biomaterials.A utilização de tecnologia de DNA recombinante permite a criação e produção de novas (re)combinações genéticas, que de outro modo não se encontram em proteínas ou péptidos naturais. Desta tecnologia surgiram os polímeros recombinantes de origem proteica (rPBPs), uma classe de biopolímeros baseada na repetição de blocos de aminoácidos normalmente encontrados em proteínas estruturais, tais como o bloco VPGVG da elastina de mamífero ou o bloco GAGAGS da fibroína da seda. Esta tese focou-se no desenvolvimento, produção e processamento de rPBPs, tendo como objetivo a sua aplicação biomédica. Os péptidos antimicrobianos (AMPs) são alternativas naturais aos antibióticos de origem química, podendo ser utilizados como domínio funcional aquando da fusão com rPBPs. Neste trabalho, procedeu-se à recombinação de sequências genéticas de rPBPs com diferentes AMPs, originando uma pletora de novos materiais cujas propriedades físico-químicas e biológicas foram analisadas. No capitulo I é apresentada uma revisão do estado de arte sobre a função, modo de ação e estrutura dos AMPs, bem como a sua utilização para a criação de polímeros com atividade antimicrobiana. Relativamente aos rPBPs, a revisão da literatura focou-se maioritariamente nas famílias dos polímeros recombinantes semelhantes à elastina (ELRs) e dos co-polímeros com base na seda e na elastina (SELP). Os capítulos II a VI focam-se na funcionalização de ELRs utilizando diferentes AMPs, bem como na caracterização e processamento dos polímeros obtidos. Os capítulos VII a IX descrevem os trabalhos desenvolvidos com o co-polímero SELP-59-A, mais especificamente na otimização da sua produção e na exploração de diferentes técnicas de processamento. O capitulo II descreve a criação, produção e purificação por meios não cromatográficos de um polímero funcional baseado no ELR A200 e no péptido ABP-CM4, originando o polímero CM4-A200. O material purificado foi processado na forma de filme apresentando alta atividade antimicrobiana contra bactérias e fungos. Os filmes não apresentaram efeitos citotóxicos em linhas celulares humanas de pele. Além disso, mantiveram-se estáveis em condições secas e húmidas, sem o uso de qualquer agente de reticulação. O ensaio ex vivo com pele de porco que foi desenvolvido demonstrou o potencial dos filmes de CM4-A200 para aplicação na pele. O trabalho com o polímero CM4-A200 processado por eletrofiação é apresentado no capítulo III. As fibras criadas foram caracterizadas e as suas propriedades comparadas com os filmes mencionados no capítulo anterior. Tal como nos filmes, as fibras apresentaram atividade antimicrobiana e ausência de efeitos citotóxicos em linhas celulares humanas. As fibras apenas se mantêm estáveis a temperaturas superiores a 30 °C, quando em condições húmidas, contudo, são mais resistentes à degradação térmica do que os filmes. No capítulo IV descreve-se a previsão de estrutura do péptido ABP-CM4 e a introdução de modificações na construção CM4-A200. No entanto, estas modificações foram ineficazes no melhoramento da atividade antimicrobiana. O processamento dos filmes de CM4-A200 foi modificado originando-se um padrão em “floresta de nanotubos”, resultando no aumento da superfície em contacto com as células de microrganismos. Esta técnica resultou numa maior atividade contra a bactéria Staphylococcus aureus. No capítulo V está descrita a modificação da sequência do péptido BMAP-28 e a sua utilização na funcionalização do polímero A200. Quando processado na forma de filme, o polímero BMAP-18A200 apresentou alta atividade antimicrobiana contra bactérias, leveduras e fungos filamentosos. A remoção dos últimos 10 aminoácidos do péptido BMAP-28 resultou na produção do polímero funcionalizado. No capítulo VI, o péptido hepcidina foi utilizado para a funcionalização do polímero A200. Este revelou propriedades antibacterianas na forma solúvel, contrariamente ao observado nos polímeros mencionados nos capítulos anteriores. No Capítulo VII descreve-se a otimização da produção do polímero recombinante SELP-59-A em Escherichia coli, obtendo-se uma produtividade volumétrica de 0,5 g/L. A otimização do método resultou num aumento de 2,5x relativamente ao descrito na literatura. No capítulo VIII, os polímeros SELP-59-A e SELP-1020-A foram processados por eletrofiação. O diâmetro das fibras foi dependente do solvente e da concentração da solução utilizados. O material demonstrou ausência de citotoxicidade em culturas de linhas celulares de pele. No capítulo IX estudou-se o processamento e caracterização de filmes de SELP-59-A. Este material mostrou-se estável até 220 °C, e apresentou propriedades de isolamento elétrico. O tratamento com metanol induziu alterações nas propriedades mecânicas e a composição com glicerol resultou num aumento da flexibilidade do material. No último capítulo (X) procedeu-se à discussão geral dos resultados apresentados e apresentam-se as perspetivas futuras. De um modo geral, esta tese providencia novas soluções para a funcionalização, produção, purificação e processamento de rPBPs. Com este trabalho pretende-se que os rPBPs aqui criados contribuam para responder à procura de novos materiais com propriedades antimicrobianas, e particularmente, na área dos biomateriais avançados.The work presented in this dissertation was performed in the Centre of Molecular and Environmental Biology (CBMA), Department of Biology, University of Minho and in the BioForge institute, University of Valladolid, Spain. The financial support was given by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) by means of a grant, SFRH/BD/75882/2011. Financial support for part of the work was supported by FCT I.P. through the strategic funding UID/BIA/04050/201