Micropartículas para libertação controlada de fármacos e metodologias inovadoras em engenharia de tecidos

Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais - Ramo do Conhecimento Engenharia de Tecidos – Materiais Híbridos.With the increase in life expectancy, there is a demand to meet new challenges in terms of health care. To the growing awareness of the need of preventive medicine, is allied the regenerative medicine, overcoming the field of replacement or repairing medicine. The advent of tissue engineering, the science of repair, has created a vast field for research both in terms of materials, as well as new biological approaches that, in combination, create hybrid materials that are expected to achieve the regeneration of the damaged organs/tissues. Within the tissue engineering field, bone is considered, together with cartilage, as one of the tissues that posses more difficulties for regeneration. Many researchers have pursued, so far without success, the creation of the ideal scaffold that could meet all the though orthopaedic demands. Another important aspect of bone tissue engineering has to do with the role of key players such as cells and growth factors. A hybrid approach, combining a scaffold material, progenitor cells and growth factors seems to hold a great potential, which has been studied by several researchers. Based on this approach, it is necessary to develop materials that can fulfill all the requirements – provide structural support, serve as carriers for cells and act as drug delivery systems – creating a material that can be a “3-in-1” system. The objectives of the present work were to develop new systems that can fulfill the requirements referred above. Microparticles based on starch-based materials were chosen, as these materials have shown potential for biomedical applications. The developed materials were evaluated in terms of their eventual bioactivity, non-cytotoxicity, ability to serve as carriers for cell adhesion and proliferation, as well as their potential to be used as controlled delivery systems either for anti-inflammatory agents or growth factors. Several starch-based materials were used for the development of polymer-based microparticles, and among them, two materials were selected for further studies: a blend of starch and polylactic acid (SPLA, 50:50 wt) and a chemically modified potato starch, Paselli 2. Both materials enabled the synthesis of particulate systems, both polymer and composite [with Bioactive Glass 45S5 (BG 45S5)]. The in vitro bioactivity of the materials, denoted by the ability of the materials to form a calcium-phosphate layer at their surface when immersed in a solution simulating the blood plasma ionic composition, was confirmed for SPLA-30%BG composites and for both polymer (Pa2) and composite (Pa2-30%BG) particles. The cytotoxicity was evaluated by using leachables of the materials, through MEM, MTT and total protein quantification. All the materials were proved to be non-toxic. The tested materials were shown to be able to support cell adhesion and proliferation throughout the culture period, while allowing the maintenance of the osteoblastic phenotype of the cells, as confirmed by RT-PCR. The developed systems were also characterized regarding their ability to be used as release systems. Two categories of bioactive agents - corticosteroids and growth factors – were incorporated within the matrix of SPLA particles. Dexamethasone and two other corticosteroids with a similar structure were chosen, the former as a differentiation agent for cells of the osteoblastic lineage and the latter as anti-inflammatory v agents. Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) was selected by its mitogenic effect over cells from the osteoblastic lineage, therefore adequate for the stimulation of cell proliferation. The loading efficiency reached values of 80% and 17% for corticosteroids and PDGF, respectively, and these are similar to the ones observed for other systems. The release profiles have shown a slow, sustained release for corticosteroids and a burst release in the initial stage for PDGF. For the latter, the low loading efficiency did not hinder the ability of this system to be used in an in vitro strategy where cell expansion is to be achieved. The mitogenic effect of PDGF after release was tested using cultures of osteoblast-like cells, which markedly showed that the incorporation and release of PDGF from starch-based microparticles does not affect its biological activity (i.e., mitogenic effect). In summary, the results of this work show that it was possible to develop starch-based microparticles, whose characterization showed that they are fabricated with controlled sizes, they are biodegradable, non-cytotoxic and bioactive, when immersed in a simulated body fluid. Additionally, the developed materials were shown to be able to incorporate and to release with a defined profile molecules pertaining to two different groups of bioactive agents (corticosteroids and growth factors) and to allow cell adhesion, proliferation and expression of the osteoblastic phenotype of primary cells and of a cell line. The results herein presented demonstrate the potential of the developed systems for application in the tissue engineering field, namely: - As possible scaffold/filling materials for applications in bone defects were non-load bearing materials are desirable; - As substrates/carriers for the culture and expansion of cells in 3-D bioreactors; - As release systems for growth factors and other biologically active molecules; - As components of a three-fold strategy incorporating the above-named points – structural support, carriers for cells and as systems for the release of biologically active agents.Com o aumento da esperança média de vida para cerca de 80 anos há necessidade de responder a novos desafios em termos de cuidados de saúde. À medicina preventiva alia-se a medicina regenerativa, em detrimento da medicina simplesmente “reparadora”. O advento da ciência da regeneração, a Engenharia de Tecidos, criou um vasto campo de investigação, quer em termos de novos materiais e materiais modificados que possam funcionar como suportes, quer em termos de novas abordagens no campo biológico que, quando combinados, tem o potencial de criar materiais híbridos que se espera venham a promover a regeneração e reparação de tecidos danificados. No campo da Engenharia de Tecidos, o osso é considerado, juntamente com a cartilagem, como um dos tecidos mais difíceis de regenerar. Muitos grupos de investigação tentam, há bastante tempo, através de várias abordagens, criar o suporte ideal que possa corresponder a todos os requisitos necessários para regenerar um tecido ósseo. Outro aspecto chave na engenharia de tecidos do osso diz respeito aos sistemas biológicos, especificamente as células ósseas e os factores de crescimento. A combinação de um material de suporte com células detentoras de potencial proliferativo e factores de crescimento constitui uma estratégia promissora neste domínio, que tem vindo a ser estudada por diversos investigadores. Com base nesta abordagem, é necessário o desenvolvimento de materiais que possam servir estas três funções – suporte estrutural, suporte para adesão e proliferação de células e como sistemas de libertação controlada de fármacos - criando um material que seja “3-em-1”. Os objectivos do presente trabalho visaram o desenvolvimento de novos sistemas que possam preencher os requisitos referidos acima. A escolha de materiais sob a forma de micropartículas, usando materiais à base de amido, apresenta um grande potencial para este tipo de abordagem. Os materiais desenvolvidos foram caracterizados em relação à sua eventual bioactividade, não citotoxicidade e capacidade de serem usados como veículos para a adesão e proliferação de células ósseas, assim como o seu potencial como sistemas de libertação de agentes anti-inflamatórios e factores de crescimento. Para o desenvolvimento das micropartículas foram usados, como matéria prima, vários materiais à base de amido. Posteriormente foram seleccionados, com base em vários critérios, dois materiais: uma mistura de amido e poliácido láctico (SPLA, 50:50 peso) e um amido de batata modificado quimicamente de modo a ser solúvel em água (Paselli 2). Ambos os materiais demonstraram capacidade de formar micropartículas, quer poliméricas, quer compósitas, reforçadas com vidro bioactivo 45S5 (BG 45S5). A bioactividade in vitro, avaliada pela capacidade dos materiais de formar ou não à superfície uma camada de fosfato de cálcio, quando imersas numa solução que simula a composição iónica do plasma sanguíneo, foi confirmada para as partículas compósitas de SPLA-30%BG e para as partículas poliméricas e compósitas de Pa2 e Pa2-30%BG, respectivamente. vii A eventual citotoxicidade dos materiais desenvolvidos foi avaliada com recurso a materiais “lixiviados” das partículas, através de testes MEM, MTT e quantificação da proteína total. Os resultados confirmam a ausência de toxicidade dos materiais. Todos os materiais testados mostraram ser capazes de permitir a adesão e proliferação das células in vitro, permitindo simultaneamente a manutenção do fenótipo osteoblástico das mesmas, como confirmado por RT-PCR e por coloração com Alizarin Red. Os sistemas desenvolvidos foram também caracterizados quanto à sua capacidade de serem usados como sistemas de libertação controlada de moléculas bioactivas. Dois representantes de moléculas bioactivas - corticosteróides e factores de crescimento - foram incorporados nas partículas de SPLA. A escolha recaiu na Dexametasona e dois outros corticosteroides, pelo papel desempenhado por estes factores como potentes anti-inflamatórios e no caso da Dexametasona como indutor da diferenciação de células na linhagem osteoblástica. De entre os factores de crescimento com efeito documentado no tecido ósseo a escolha recaiu no Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), que tem um efeito mitogénico sobre osteoblastos e, como tal, será adequado para estimular a expansão celular. A eficiência de incorporação atingiu valores de cerca de 80% e 17% para os corticosteróides e para o PDGF, respectivamente, semelhantes aos observados para outros sistemas. Os perfis de libertação revelaram uma libertação lenta dos corticosteróides e rápida, nos estados iniciais, para o factor de crescimento. Para o PDGF, o baixo valor de incorporação observado não impediu, no entanto, de observar in vitro um perfil de libertação desejável para expansão da população celular. A capacidade mitogénica do PDGF após incorporação e libertação foi avaliada com recurso a culturas de células osteoblásticas, que mostrou que células estimuladas com PDGF libertado das micropartículas proliferaram a uma taxa superior às células não estimuladas. Em suma, os resultados deste trabalho mostram que foi possível desenvolver micropartículas à base de amido, cuja caracterização revelou que podem ser produzidas com tamanhos definidos, são biodegradáveis, não são citotóxicas e são bioactivas quando imersas numa solução que simula a composição iónica do plasma sanguíneo. Adicionalmente, os materiais desenvolvidos demonstraram possuir a capacidade de incorporar e libertar, com um perfil definido, moléculas pertencentes a dois grupos distintos (corticosteróides e factores de crescimento) e permitirem a adesão, proliferação, assim como a expressão do fenótipo osteoblástico de culturas primárias e de uma linha celular. Os resultados aqui apresentados demonstram o potencial dos sistemas desenvolvidos para aplicação em engenharia de tecidos, nomeadamente: - Como possíveis materiais de suporte para preenchimento de defeitos ósseos em aplicações que não exijam elevadas propriedades mecânicas; - Como suportes para a cultura e expansão de células em bioreactores tridimensionais; - Como sistemas de libertação controlada de fármacos e factores de crescimento. - Como componentes de uma estratégia de engenharia de tecidos, combinando num só material propriedades como suporte estrutural, suportes para a cultura de células e como sistemas de libertação controlada de fármacos.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT).Fundação Calouste Gulbenkian.União Europeia - Projecto Hippocrates.União Europeia - Projecto Expertissues