Matrizes tridimensionais porosas, hidrogéis e materiais reforçados com fosfatos de cálcio à base de fibroína de seda para aplicação em medicina regenerativa

Tese de doutoramento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e Células EstaminaisBone and cartilage defects derived from trauma or disease are major problems in orthopedics. Tissue engineering and regenerative medicine provides promising strategies for the regeneration of damaged tissues. Biomaterials, processed into porous scaffolds and hydrogels, have been playing a crucial role in the tissue regeneration. Controlling the physicochemical properties of biomaterials is important for inducing proper cellular response towards tissue formation, thus facilitating the regeneration procedure. While the ideal tissue regeneration outcome has not yet been achieved, great progress had been made in the last decades, in terms of the application of biomaterials for tissue regeneration. The aim of this thesis is to develop novel silk fibroin (SF) based porous scaffolds and hydrogels with adequate properties and controlled conformations for different tissues regeneration. Several strategies were used in this thesis, including the improvement of scaffolds’ strength, biomimetic of the tissue composition and stratified structure, and development of stimuli-responsive hydrogels with injectable or spatial tunable properties. SF derived from Bombyx mori cocoons was chosen as the matrix material because it has many advantages. It is a biodegradable protein based biomaterial with superior in vitro and in vivo biocompatibility. Moreover, its mechanical properties and degradation profile can be tuned by the processing approach. SF can be processed into different shapes and architectures, and it is a readily available supply. Salt-leached SF scaffolds with superior mechanical properties were produced by using highly concentrated aqueous SF solutions. The compressive and storage moduli of the scaffolds were significantly enhanced with increasing the concentration of SF solution. The developed scaffolds were of macro/microporous structure, high porosity and interconnectivity, and presented a homogeneous porosity distribution. The obtained scaffolds present adequate properties for cartilage and meniscus regeneration. Mimicking the composition of natural bone, composite scaffolds composed of SF and calcium phosphate were developed for bone regeneration. Nano calcium phosphate particles were incorporated in the concentrated SF solution using an in-situ synthesis method following saltleaching to develop the silk-nano calcium phosphate (Silk-NanoCaP). These scaffolds maintained the superior mechanical properties of SF scaffolds but demonstrated in vitro bioactivity. The NanoCaP particles were homogeneously distributed in the silk matrix, at both macroscopic and microscopic levels. The leachables of the scaffolds were non-cytotoxic as determined by in vitro cytotoxicity assays. The in vitro and in vivo biological performance of both SF and Silk-NanoCaP scaffolds was further evaluated. These scaffolds supported the viability and proliferation of human adipose tissue derived stromal cells. The formed extracellular matrix improved the mechanical properties of the cell-laden scaffolds or constructs. In vivo, both scaffolds have supported de novo bone formation and ingrowth’s and induced no acute inflammatory response. The Silk NanoCaP scaffold was osteoconductive as new bone grew directly on its surface. This group induced higher amount of new bone formation than the SF group. The Silk-NanoCaP scaffolds can be used in bone regeneration. Considering the stratified/composition characteristics of osteochondral tissue, bilayered scaffolds composed of a SF layer and a Silk-NanoCaP layer were produced for osteochondral defects (OCD) regeneration. The in vitro bioactivity was only observed in the Silk-NanoCaP layer i.e., the bone-like layer. When seeded with marrow mesenchymal stromal cells, the bilayered scaffolds promoted cell viability and proliferation, and the Silk- NanoCaP layer induced a higher alkaline phosphatase level as compared to the SF layer (cartilage-like layer). In vivo subcutaneous implantation showed that the scaffolds supported tissue infiltration and no granulation tissue or acute inflammation were observed. When implanted in the rabbit OCD, the bilayered scaffolds supported cartilage regeneration in the SF layer and promoted bone ingrowths in the Silk-NanoCaP layer. Therefore, they demonstrated to be promising candidates for OCD regeneration. Besides the development of SF based scaffolds, another approach explored in this thesis was to develop injectable and enzymatically cross-linked SF hydrogels that could be suitable for cartilage regeneration. The SF hydrogels were prepared by peroxidase mediated crosslinking of the tyrosine groups in the backbone of SF. These hydrogels could be formed in a few minutes under physiological conditions. Dominant amorphous conformation was presented in these hydrogels. These hydrogels were ionic strength and pH stimuli responsive. Cells were successfully encapsulated into these hydrogels. Subcutaneous implantation showed that these hydrogels did not induce any acute inflammatory reaction. After in vitro cell culture or in vivo implantation, β-sheet conformation was observed in these hydrogels. The developed SF hydrogels can be used as an injectable material for filling tissue defects (such as bone or cartilage) or as a drug delivery system. Finally, SF hydrogels with spatially controllable properties were generated. Core-shell SF hydrogels consisted in a β-sheet conformation in the shell layer and mainly an amorphous conformation in the core layer. These were prepared by the controlled immersion of the peroxidase mediated SF hydrogels in methanol. The thickness of the shell layer and the mechanical properties of the core-shell SF hydrogels increased with increasing the immersion time. When incorporating albumin as a model drug, the core-shell SF hydrogels presented slower and more controllable release profile as compared to the SF hydrogel. The core-shell SF hydrogels can be used as a controlled release system, tissue substitute or both. In this thesis, different strategies for developing novel SF based scaffolds and enzymatically cross-linked hydrogels were explored. In both cases remarkable properties and functions for tissue engineering and regenerative medicine applications were achieved, as well as a high reproducibility of the systems. The SF based scaffolds and enzymatically cross-linked SF hydrogels provided herein can be promising candidates for cartilage, meniscus, bone, and osteochondral regeneration, as well as drug delivery systems or tissue substitutes.Os defeitos ósseos e de cartilagem resultantes de trauma ou de um processo degenerativo são os principais problemas em ortopedia. As áreas da engenharia de tecidos e a medicina regenerativa têm permitido propor um conjunto de estratégias promissoras para a regeneração dos tecidos danificados. Neste âmbito, os biomateriais quando processados sob a forma de matrizes tridimensionais porosas e hidrogéis têm desempenhado um papel crucial na regeneração dos tecidos. Mas o controlo das propriedades dos biomateriais é também importante, uma vez que influenciam a resposta celular e a formação do novo tecido. Assim sendo, a melhoria das propriedades físico-químicas dos biomateriais como estratégia para a optimização do processo de regeneração de tecidos, científicas de maior relevo por forma a facilitar o processo de regeneração constitui uma questão científica relevante. Esta tese tem como objetivo o desenvolvimento de novas matrizes tridimensionais prorosas e hidrogéis à base de fibroína de seda (FS) com propriedades adequadas e conformações controladas para regeneração de diferentes tecidos. Neste contexto, foram utilizadas várias estratégias, incluindo a melhoria das propriedades mecânicas, utilização de composições biomiméticas e abordagens de estratificação no processo de produção das matrizes tridimensionais porosas, e desenvolvidos hidrogéis injetáveis e sensíveis a estímulos com propriedades ajustáveis. A FS derivada de casulos da espécie de Bombyx mori foi escolhida como o material base, dado que possui inúmeras vantagens. É um biomaterial de natureza protéica e biodegradável, e cuja biocompatibilidade tem sido demonstrada in-vitro e in-vivo. Além disso, as propriedades mecânicas e o perfil de degradação podem ser optimizados durante as várias etapas de processamento. A FS pode ser ainda processada em diferentes formas e arquiteturas, sendo uma fonte prontamente disponível. Inicialmente, foram produzidas matrizes tridimensionais porosas através do processo de “saltleaching”. Estas matrizes apresentam propriedades mecânicas superiores, uma vez que foram usadas soluções aquosas de FS altamente concentradas. Os módulos de elasticidade e de compressão das estruturas obtidas foram significativamente melhorados com o aumento da concentração da solução de FS. As matrizes desenvolvidas apresentam uma estrutura com macro- e micro-porosidade, interconectividade, e distribuição homogénea dos poros. As matrizes obtidas apresentam propriedades adequadas para a regeneração de cartilagem e menisco. Por forma a mimetizar a composição natural do osso e promover a regeneração óssea, foram desenvolvidas estruturas compósitas de FS e fosfato de cálcio. Assim, foi desenvolvido uma matriz tridimensional porosa e compósita de seda-nanofosfato de cálcio (Seda-NanoCaP), através da síntese in-situ de nanopartículas de fosfato de cálcio na solução de FS concentrada, seguido do método de “salt-leaching”. Estas matrizes possuem propriedades mecânicas superiores, e apresentam bioatividade in-vitro. As partículas de NanoCaP foram homogeneamente distribuídas na matriz de seda, ao nível macroscópico e microscópico. Verificou-se que os materiais lixiviados destas estruturas não são citotóxicos, tal como demonstrado em ensaios de avaliação da citotoxicidade invitro. O desempenho biológico de ambas as matrizes de FS e seda- NanoCaP foi ainda avaliado in-vitro e in-vivo. Estas matrizes tridimensionais porosas suportaram a viabilidade e proliferação de células obtidas do estroma de tecido adiposo humano. A matriz extracelular produzida, permitiu melhorar as propriedades mecânicas dos dois tipos de matrizes tridimensionais porosas de SF. In-vivo, ambas as matrizes permitiram a formação de novo osso sem indução de resposta inflamatória aguda. No entanto, a matriz de seda-NanoCaP tem capacidade osteocondutora superior, uma vez que suportou o crescimento de novo osso directamente na sua superfície. Estas estruturas tridimensionais porosas e compósitas induziram uma maior quantidade de formação de novo osso em comparação com a matriz de FS. Desta forma as matrizes de seda-NanoCaP são as mais adequadas para serem utilizadas na regeneração óssea. Considerando as características do tecido osteocondral e a sua composição estratificada foram desenvolvidas matrizes tridimensionais porosas em bicamada, constituídas por uma camada de SF e uma camada compósita de Seda-NanoCaP para a regeneração de defeitos osteocondrais (DOC). A bioatividade in-vitro foi observada apenas na camada Seda-NanoCaP, a camada semelhante ao osso. Quando cultivada com células mesenquimais isoladas da medula óssea, as matrizes de bicamada promoveram a viabilidade e proliferação celular. A camada de seda-NanoCaP induziu uma expressão mais elevada da fosfatase alcalina em comparação com a camada de FS. In-vivo, as matrizes tridimensionais porosas de bicamada permitiram a infiltração de tecido e não foi observado tecido de granulação ou inflamação aguda, após a implantação subcutânea. Quando implantado num DOC crítico em modelo de coelho, as matrizes de bicamada permitiram a regeneração da cartilagem na camada de FS e o crescimento ósseo na camada de Seda-NanoCaP. Desta forma, estas matrizes mostraram ser muito promissoras na regeneração osteocondral. Além do desenvolvimento de matrizes tridimensionais porosas à base de FS para a regeneração da cartilagem, foram também produzidos com sucesso hidrogéis injectáveis, reticulados por via enzimática. Os hidrogéis de FS foram preparados a partir da reticulação dos grupos de tirosina na cadeia principal da FS, recorrendo à actividade da enzima peroxidase. Estes hidrogéis formam-se em poucos minutos e em condições semelhantes às condições fisiológicas. Apresentam uma conformação amorfa dominante, e são sensíveis a estímulos de força iónica e pH. Permitem também o encapsulamento de células. Através de um implante subcutâneo foi possível demonstrar que os hidrogéis não induzem reação inflamatória aguda, em modelo de ratinho. Após cultura de células invitro ou implantação in-vivo, foi observada a alteração de conformação para folha β nestes hidrogéis. Os hidrogéis desenvolvidos podem ser utilizados como um material injectável para o preenchimento de defeitos em tecidos, tais como osso e cartilagem ou como um sistema de libertação controlada de fármacos. Finalmente, foram desenvolvidos hidrogéis de FS com propriedades controláveis ao nível espacial. Estes hidrogéis de FS apresentam uma camada externa em conformação de folha β e um núcleo amorfo, e foram preparados por imersão controlada do gel em metanol, após reticulação enzimática. A espessura da camada de invólucro e as propriedades mecânicas dos hidrogéis de FS aumentam ao longo do tempo de imersão em metanol. Em estudos de prova de conceito usando a albumina como um fármaco-modelo, os hidrogéis revestidos apresentam um perfil de libertação mais lento e controlável, em comparação com o hidrogel de SF não tratado com metanol. Os hidrogéis com diferentes conformações podem ser usados como sistemas de libertação controlada, substitutos de tecidos ou ambos. Nesta tese, foram exploradas diferentes estratégias para o desenvolvimento de matrizes tridimensionais porosas e hidrogéis reticulados por via enzimática. Em ambos os casos foram obtidas propriedades e funções notáveis para aplicações em diferentes abordagens da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, bem como uma elevada reprodutibilidade dos sistemas. As matrizes tridimensionais porosas de FS e os hidrogéis reticulados enzimaticamente aqui propostos constituem candidatos promissores para a regeneração de cartilagem, menisco, osso e tecido osteocondral, podendo actuar simultaneamente como um sistema para a libertação controlada de fármacos.Foundation for Science and Technology (FCT) PhD scholarship (SFRH/BD/64717/2009). Chinese Scholarship Council (CSC) for granting the “2012 Chinese Government Award for Outstanding Self-financed Students Abroad”