Development and evaluation of peptide nucleic acid (PNA) probes for the rapid detection of clinically relevant microorganisms

Tese de doutoramento em Engenharia BiomédicaMicrobial infections are a major cause of hospitalization leading to high morbidity and mortality. An earlier diagnosis can ensure a more rapid treatment, preventing a worse-case scenario. However, ineffective treatments due to inaccurate microorganism identification can lead to hospitalization extension, undesirable side effects, antimicrobial resistance and increased economic costs. Currently, culturing and serologic methods are the methods of choice in clinical diagnosis, but they lack specificity and are time-consuming. PCR based techniques are frequently used, but they are technically-demanding and need DNA manipulation, being prone to contaminations. Therefore, the development of new molecular techniques more specific, reliable and simpler to use is of great concern. Peptide nucleic acid oligonucleotides can be used with fluorescence in situ hybridization as an alternative molecular method to specifically target the rRNA of microorganisms. In the first part of this thesis, it was intended to design and optimize specific probes for the detection of clinical relevant microorganisms, such as, Helicobacter pylori and its clarithromycin resistance and Aspergillus fumigatus detection. With the application of this technique on different cellular morphologies and in different microbial domains it can be definitely proved the capacity of this method to be used as diagnostic method. H. pylori can colonize the human stomach and cause severe gastric diseases. The standard triple therapy where clarithromycin is the main antibiotic used, is given indiscriminately to all symptomatic patients, leading to antimicrobial resistance. In this study three probes were designed, targeting the three most prevalent clarithromycin resistance point mutations (Hp1, Hp2 and Hp3) in the positions A2143G, A2142G and A2142C of the peptidyltransferase region encoded in domain V of the H. pylori 23S rRNA gene. An additional probe targeting susceptible strains (Hpwt) was also developed and tested simultaneously in H. pylori smears with known clarithromycin resistance profile (specificity and sensitivity of 100%). For method validation in gastric biopsies, a retrospective and prospective cohort studies were made where validity indexes such as sensitivity, specificity and likelihood ratios were assessed to test PNAFISH accuracy. In the retrospective assay, full agreement between PNA-FISH and PCR was achieved, but comparing to the reference method based on culture techniques, the specificity was of 90.9% and sensitivity was of 84.2%. In the prospective cohort study comparing to reference method, PNA-FISH demonstrated that can always detect H. pylori resistant and susceptible genotypes (sensitivity and specificity are 100%). Discrepancies detected between positive PNA-FISH results and negative in the reference method can be explained by some culturing method shortcomings, such as difficulty on H. pylori growth in certain media, contaminations and the viable but non-cultivable state of the bacteria (VBNC). Aspergillus fumigatus is a filamentous fungus that produces conidia. When inhaled, conidia can adhere to epithelial lung cells, leading to pulmonary diseases such as Invasive Aspergillosis. The designed probe could discriminate A. fumigatus from other species, presenting practical specificity and sensitivity of 100%. A germination assay was done to assess probe performance for different cells morphology along mold germination. At 0h and 2h the signal was faint due to lack of ribosome content and cell wall structure. From 4h onwards swelling conidia can be observed, and germ tubes start to appear at 6h. Partial and full germination were detected at 8h and 12h, respectively. This germination process was followed by a signal intensity increase that was not uniform throughout the cell, as more intense fluorescence dots near the nucleus appeared. These dots may correspond to increased ribosomal content. Different concentrations of this fungus were applied on artificially contaminated samples for A. fumigatus detection testing. In blood it was possible to detect this mold as early as 6h at concentrations ranging 1x103 - 1x104 cells ml-1. In artificial sputum media it was only possible to detect A. fumigatus from 16h to 24h at concentrations of 1x102 cells ml-1. In addition, and as a final aim of this work, it was used a commercially available PNA-FISH kit to study Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa biofilm interactions simulating urinary catheters conditions, to demonstrate the potential uses of PNA-FISH. These two bacteria are some of the main responsible for catheters associated urinary tract infections, mainly due to catheter biofilm formation. DAPI staining and CFUs counts in silicon coupons embedded in artificial urine, were used in addition to E. coli/P. aeruginosa PNA-FISH® probes to have an overlook of the behavior in terms of biofilm formation capacity of these two bacteria in single and mixed biofilms. In single-species biofilms it was possible to observe that E. coli appears to form more easily biofilm than P. aeruginosa. From all the results for mixed-biofilms it was possible to infer that some sort of interaction between these two species is happening although P. aeruginosa seems to benefit the most (Log 7 CFU of P. aeruginosa/cm2, comparing to Log 6 CFU/cm2 obtained in pure cultures) comparing to E. coli that decreased cell concentration in presence of the other counterpart. The PNA-FISH combined with CLSM could indeed confirm P. aeruginosa outcompeting E. coli in dual-species biofilms. This probably happens due to P. aeruginosa secreting substances that can be toxic to cultivable E. coli cells, preventing them to proliferate. In fact, although this is the main causative agent of urinary infections for its constant presence in infection places and for its capacity of forming singlespecies biofilm, in the presence of other bacteria seems to lose that capacity. The whole results from this thesis indicate that PNA-FISH is a reliable technique for the specific identification of microorganisms or its genotypic characteristics and it can be used as a method of diagnosis ready to use, in clinical practice or as a mean for studying important microorganism’s mechanisms in research laboratories. It can also be used to discriminate populations in biofilms, as the uncharged backbone of the PNA molecule allows it to diffuse more freely through the biofilm matrix providing a more comprehensive view of the biofilm structure. This feature may allow the more effective development of new eradication therapies.As infecções causadas por microrganismos são uma das maiores causas de hospitalização, que conduzem a graus de morbilidade e mortalidade elevados. Um diagnóstico precoce assegura que o tratamento é mais efectivo, prevenindo o pior cenário. No entanto, os tratamentos são por vezes ineficientes devido à dificuldade de identificar o microrganismo causador de doença, o que levam a maiores períodos de internamento, efeitos secundários indesejáveis, aumento de resistências a substâncias antimicrobianas e aos aumentos dos custos associados. Actualmente, os métodos mais utilizados em diagnóstico clínico são os métodos de cultura e serológicos, mas apresentam algumas limitações pois são muito demorados e pouco sensíveis. Os métodos baseados em PCR também são frequentemente utilizados mas são tecnicamente exaustivos e como envolvem extracção de ADN, estão sujeitos, muitas vezes, a contaminações. Assim, tem sido dada importância ao desenvolvimento de novas técnicas moleculares mais específicas, seguras e mais fáceis de usar. Sondas de ácido péptido nucleico (PNA) têm sido usadas em associação com hibridação fluorescente in situ (FISH) como um método molecular alternativo por se ligarem de um modo específico ao rARN de microrganismos. A primeira parte do trabalho destinou-se ao desenho e optimização de sondas específicas para detecção de microrganismos clinicamente relevantes como a Helicobacter pylori e a sua resistência à claritromicina e detecção do Aspergillus fumigatus. Com a aplicação desta técnica em diferentes morfologias celulares e nos diferentes domínios microbianos fica definitivamente provada a capacidade deste método para ser usado como método de diagnóstico. A H. pylori é uma bactéria colonizadora do estômago humano, que pode causar doenças gástricas severas. A terapia utilizada mais comum é a terapia tripla onde a claritromicina é o antibiótico mais comummente usado, e é administrada indiscriminadamente a todos os pacientes que apresentam sintomas levando a um elevado grau de resistência deste antibiótico. Neste estudo, foram desenhadas três sondas relativas às três mutações pontuais que conferem resistência à claritromicina (Hp1, Hp2 e Hp3) que se encontram nas posições A2143G, A2142G e A2142C da região peptidiltransferase do domínio V do 23S rRNA. Adicionalmente foi desenhada outra sonda que se liga a estirpes susceptíveis a este antibiótico (Hpwt). Estas sondas foram testadas em esfregaços contendo estirpes de H. pylori com perfil de resistência à claritromicina conhecido (especificidade e sensibilidade de 100%). Para validação da precisão do método em biopsias gástricas foram feitos estudos cohort retrospectivo e prospectivo, onde se testaram alguns índices de validade como a sensibilidade, a especificidade e razões de verosimilhança. No teste retrospectivo, verificou-se concordância total entre o PNA-FISH e o PCR, mas comparando-se os resultados com o teste de cultura de referência a especificidade foi de 90.9% e a sensibilidade de 84.2%. No teste prospectivo e comparando com o método de referência, o PNA-FISH demonstrou que consegue sempre detectar H. pylori com resistência ou susceptibilidade à claritromicina (sensibilidade e especificidade são 100%). As discrepâncias entre os resultados que deram positivo para o PNA-FISH, mas não para o método de referência, podem ser explicadas por algumas lacunas apresentadas pelos métodos de cultura, como por exemplo, o facto de ser por vezes difícil de fazer crescer a H. pylori em certos meios, contaminações e os diferentes estados de cultivabilidade da bactéria (VBNC). O Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso que produz conídios. Quando inalados, os conídios aderem às células epiteliais do pulmão, originando doenças pulmonares como a Aspergilose Invasiva. A sonda desenhada foi capaz de descriminar as estirpes de A. fumigatus de entre todas as estudadas, apresentando especificidade e sensibilidade práticas de 100%. Foram feitos ensaios de germinação de modo a verificar se o desempenho da sonda seria idêntico nas diferentes estruturas do fungo, que aparecem ao longo do processo de germinação. Nas 0h e nas 2h o sinal apresentou-se fraco devido ao baixo conteúdo ribossomal e à estrutura da parede celular dos conídios. A partir das 4h, pôde-se observar a dilatação dos conídios e às 6h o início do aparecimento de tubos germinativos. Às 8h e às 12h foi possível observar-se germinação parcial e total, respectivamente. Todo o processo germinativo foi seguido de um aumento de sinal de fluorescência, que no entanto, não era uniforme em toda a célula, mas com pontos mais fortes perto do núcleo, que poderão corresponder a um aumento do conteúdo ribossomal. Foram aplicadas concentrações seriadas de A. fumigatus em amostras artificialmente contaminadas para detecção do fungo. No sangue foi possível de detectar este fungo logo às 6h, a concentrações compreendidas entre 1x103 -1x104 cells ml-1. Em meio de expectoração artificial foi apenas possível detectá-lo entre as 16h e as 24h a concentrações de 1x102 cells ml-1. No último objectivo deste trabalho, um kit multiplex de sondas de PNAFISH foi utilizado para estudar as interacções entre Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa em biofilmes, simulando as condições em cateteres urinários, como forma de demonstrar os potenciais usos desta técnica. Estas duas bactérias são duas das mais frequentemente responsáveis por infecções do tracto urinário associadas a cateteres, especialmente devido à formação de biofilmes nestes dispositivos médicos. O método de coloração por DAPI e a contagem de unidades formadoras de colónias, em cupões de silicone imersos em urina artificial foram usados em conjunto com as sondas do kit E. coli/P. aeruginosa PNA-FISH® para se obter uma visão generalizada do comportamento destas duas bactérias em biofilmes simples e mistos. Em biofilmes simples é possível observar que a E. coli parece formar biofilme mais facilmente que a P. aeruginosa. Relativamente aos biofilmes mistos, os resultados parecem indicar que existe uma interacção entre estas duas bactérias. No entanto, enquanto a P. aeruginosa parece beneficiar da presença da E. coli (Log 7 CFU de P. aeruginosa/cm2, comparando com Log 6 CFU/cm2 obtidos em culturas puras), a E. coli decresce a sua concentração celular na presença da outra espécie constituinte. A técnica de PNA-FISH em combinação com microscopia confocal (CLSM) pode, de facto, confirmar a superação da P. aeruginosa sobre a E. coli em biofilmes de duas espécies. Este fenómeno provavelmente ocorre pela secreção, pela P. aeruginosa, de substâncias que podem ser tóxicas para a E. coli, impedindo a sua proliferação. Assim, embora a E. coli seja o agente infeccioso mais comum em infecções urinárias pela sua presença constante nos locais de infecção e pela capacidade de formar biofilme simples, na presença de outra bactéria, parece perder essa capacidade. No total, os resultados desta tese indicam que o PNA-FISH é uma técnica segura, adequada para a identificação específica de microrganismos ou suas características genotípicas e que pode ser usada como um método de diagnóstico disponível em prática clínica ou como meio de estudar importantes mecanismos dos microrganismos em laboratórios de pesquisa. Esta técnica também poderá ser usada para descriminar populações em biofilmes devido à estrutura não carregada da molécula de PNA que lhe permite uma melhor difusão na matriz do biofilme, o que levará a uma visão mais esclarecedora acerca da estrutura dos biofilmes. Esta particularidade poderá permitir o estudo de novas terapias de erradicação.A tese de doutoramento aqui apresentada foi suportada por uma bolsa de doutoramento financiada pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) com a referência SFRH/BD/38124/2007 financiada pelo Programa Operacional Potencial Humano- Quadro de Referência Estratégico Nacional (POPH – QREN) - Tipologia 4.1 - Formação Avançada, comparticipado pelo Fundo Social Europeu (FSE) e por fundos nacionais do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES)