Bioethanol: robust production strains for process intensification

Tese de Doutoramento em Engenharia Química e Biológica.The production of bioethanol operating at high substrate loading improves the overall process productivity and reduces initial capital investment and water consumption comparing to processing at normal gravity. However, there are some inhibition issues that become more severe under these operation conditions. This thesis focused on the development of efficient 1st and 2nd generation bioethanol production processes running at high substrate concentration. Driven by the promising results obtained in 1st generation Very High Gravity (VHG) processes, an approach to the 2nd generation processes was then implemented aiming a better understanding of the physiological responses of yeast under stressful conditions. Aiming the fulfilment of Saccharomyces cereviae nutritional requirements for maximal ethanol production, a factorial design approach was successfully employed to optimize a high-level glucose medium (330 g/L) based in Corn step liquor (CSL) and other low-cost nutrients. Using the optimized medium (g/L: CSL 44.3, urea 2.3, MgSO4·7H2O 3.8 and CuSO4·5H2O 0.03), PE-2 and CA1185 isolates exhibited the best overall fermentation performance, among the eleven laboratory and industrial background strains tested. PE-2 and CA1185 isolates produced high ethanol titres (up to 19 %, v/v) with high ethanol batch productivity (> 2.3 g/Lh). These outstanding ethanol titres obtained by industrial strains were accompanied by an increased content of sterols (2 to 5- fold), glycogen (2 to 4-fold) and trehalose (1.1-fold), relatively to CEN.PK 113-7D laboratory strain, which demonstrate their robustness to cope with VHG stresses. Driven by the detailed physiological information of these industrial isolates, a VHG repeated-batch fermentation system, using the PE-2 strain, was successfully operated during fifteen consecutive cycles, attaining an average ethanol titre of 17.1% (v/v) and batch productivity of 3.51 g/Lh. To further understand how the inhibitory conditions influence the physiology and metabolism of the producing cells at the genetic level, an approach for identifying key genes common to relevant stresses in bioethanol fermentations and validating the identified genes under industrial relevant fermentation conditions, was conducted. Primarily, the intersection of chemogenomic data previous obtained in single stress phenotypic analysis allowed the identification of eight genes simultaneously involved in yeast tolerance to VHG-related stresses. Comparative VHG fermentation tests, showed that five of them are required for maximal fermentation performance: genes BUD31 and HPR1 were found to lead to the increase of both ethanol yield and fermentation rate, while PHO85, VRP1 and YGL024w genes were required for maximal ethanol production. Aiming a complementary approach to identify key genes and confirm their role in inhibitor tolerance, a genome-wide survey of S. cerevisiae genes implicated in resistance to an industrial Wheat Straw Hydrolysate (WSH) was conducted. The results highlight the genes associated to vitamin metabolism, mitochondrial and peroxisomal functions, ribosome biogenesis and microtubule biogenesis and dynamics among the newly found determinants of WSH resistance. Moreover, comparing the results of WSH fermentations, with the genes identified in WSH genome-wide survey, PRS3, VMA8, ERG2, RAV1 and RPB4 were highlighted as key genes on yeast tolerance and fermentation of industrial WSH. Robust industrial isolates were further evaluated in fermentation of Eucalyptus globulus wood hydrolysate (114 g/L glucose). PE-2 isolate was able to resourcefully degrade furfural and HMF inhibitors attaining a remarkable final ethanol titre of 6.9% (v/v) and productivity of 0.8 g/L.A produção de bioetanol através da operação a alta concentração de substrato aumenta a produtividade global do processo e reduz o capital de investimento inicial e consumo de água comparando com o processamento a concentração normal. No entanto, existem alguns problemas de inibição que se tornam mais graves nestas condições de operação. Esta tese focou-se no desenvolvimento de processos eficientes de produção de bioetanol de primeira e segunda geração recorrendo a elevada concentração de substrato inicial. Devido aos promissores resultados obtidos nos processos “Very High Gravity, (VHG)” de primeira geração, uma abordagem aos processos de segunda geração foi então implementada visando um melhor entendimento das respostas fisiológicas da levedura em condições de stress. Com o objectivo de preencher os requisitos nutricionais da levedura Saccharomyces cerevisiae para uma máxima produção de etanol, uma metodologia de desenho factorial foi aplicada com sucesso para otimizar um meio de cultura com elevados níveis de glucose (330 g/L) baseado em “Corn steep liquor, (CSL)” e outros nutrientes de baixo custo. Usando o meio de cultura otimizado (g/L: CSL 44.3, ureia 2.3, MgSO4·7H2O 3.8 e CuSO4·5H2O 0.03), os isolados de levedura PE-2 e CA1185 apresentaram a melhor performance global de fermentação, entre as onze estirpes laboratoriais e industriais testadas. Os isolados PE-2 e CA1185 produziram elevados teores de etanol (mais de 19% v/v) com elevada produtividade (>2.3 g/Lh). Estes notáveis teores de etanol obtidos pelas estirpes industriais foram acompanhados por um aumento no teor de esteróis (2 a 5 vezes), glicogénio (2 a 4 vezes) e trealose (1.1 vezes), relativamente à estirpe laboratorial CEN.PK 113-7D, o que demonstra a sua robustez para superar o stress em condições “VHG”. Motivado pela detalhada informação fisiológica obtida destes isolados industriais, um sistema de fermentação com reciclagem de levedura em condições “VHG”, usando a estirpe PE-2, foi operado com sucesso durante quinze ciclos consecutivos, obtendo-se um teor de etanol médio de 17.1% (v/v) e produtividade de 3.51g/Lh. Para melhor compreender a forma como as condições inibitórias influenciam a fisiologia e metabolismo das células produtoras a nível genético, foi realizada uma abordagem para identificar genes chave comuns aos diferentes stresses em fermentações de bioetanol e validar os genes identificados em condições de fermentação relevantes a nível industrial. Primeiramente, o cruzamento de dados de análise quimiogenómica, previamente obtidos em análises de fenótipo a um único stress, permitiram a identificação de oito genes simultaneamente envolvidos na tolerância da levedura aos stresses relacionados com as condições “VHG”. Testes comparativos de fermentação em condições “VHG”, mostraram que cinco destes genes eram necessários para um desempenho fermentativo máximo: a presença dos genes BUD31 e HPR1 levaram ao aumento dos rendimentos em etanol e taxas de fermentação, enquanto que os genes PHO85, VRP1 e YGL024w mostraram ser necessários para uma máxima produção de etanol. Visando uma abordagem complementar para identificar genes chave e confirmar o seu papel na tolerância aos inibidores, foi realizada uma pesquisa baseada numa análise à escala do genoma de genes S. cerevisiae envolvidos na resistência a um hidrolisado de palha de trigo. Os resultados destacaram os genes associados ao metabolismo das vitaminas, funções da mitocôndria e peroxissomas, biogénese dos ribossomas e biogénese dos microtúbulos, entre os novos determinantes na resistência aos hidrolisados de palha de trigo. Além disso, comparando os resultados das fermentações em hidrolisado de palha de trigo, com os genes identificados na análise à escala do genoma, distinguiram-se os genes PRS3, VMA8, ERG2, RAV1 e RPB4 como genes chave na tolerância da levedura e fermentação de hidrolisados de palha de trigo industriais. Isolados de leveduras industriais foram avaliados na fermentação de um hidrolisado de “Eucalyptus globulus” (114 g/L). O isolado PE-2 foi capaz de degradar eficientemente os inibitórios furfural e HMF obtendo-se um notável teor de etanol final de 6.9% (v/v) e produtividade de 0.8 g/Lh.Fundação para a Ciência e a Tecnologia PhD grant SFRH/BD/64776/2009PROBIOETANOL PTDC/BIO/66151/2006GlycoCBMs PTDC/AGR-FOR/3090/2012 - FCOMP-01-0124-FEDER-02794