Processing and characterization of piezoelectric polymers for tissue engineering applications

Tese de doutoramento em Ciências (ramo de conhecimento em Física)In the last decades, the biomaterials and tissue engineering interdisciplinary research fields have been two of the most dynamic ones and have attracted increasing attention by the scientific community. With the advancements in the tissue engineering field the necessity of study and develop a wide variety of biomaterials with different properties has emerged. Among the different types of materials, polymers have proved to be an excellent choice, due to their simple processing, flexibility, physical properties and due to be easy to get in different shapes. In particular, piezoelectric polymers have attracted interest since they respond to electrical and mechanical solicitations, allowing to actively stimulating tissues. Further, interesting for tissue engineering are the polymer structures in the form of micro and nanofibers. In this work, the processing and characterization of two piezoelectric polymers, poly(Llactic acid) (PLLA) and poly(vinylidene fluoride) (PVDF), aiming tissue engineering applications was achieved. Processing was achieved both in the form of films and fibers. PLLA and PVDF electrospun fibers morphology was controlled by changing process parameters such as applied voltage, feed rate and collector system. Regarding PVDF fibers, the processing parameters allows to change the -phase fraction between 50% and 85% and fiber diameter from a few hundreds of nanometers to micrometers. Concerning PLLA fibers, the crystallinity was tailored between 0%, i.e. amorphous fibers, and 50%, by annealing treatment. The PLLA fibers diameter was further reduced by the introduction of poly(ethylene oxide) (PEO) polymer. In this way, electrospun membranes were prepared with tailored fiber diameter from some micrometers for pure PLLA membranes to few hundreds of nanometers by electrospinning of PLLA-PEO solution. PLLA degradation was also studied and it was observed that the samples degradation in phosphate buffer solution (PBS) up to 20 weeks produces only a slight decrease in the sample weight. The local properties of the PLLA and PVDF individual electrospun fibers were studied by piezoelectric force microscopy (PFM) and the piezoelectric response for both polymers have been proved. Additionally, the biological response of PLLA and PVDF membranes was also addressed. In the case of PLLA electrospun membranes, human chondrocytes were used and it was found that proliferation of human chondrocytes cultured in the monolayer substrates is not different on aligned or non-aligned amorphous mats. However, the differentiation rate seems to be higher on the non-aligned amorphous mats. Furthermore, the crystallization of the aligned mats showed nearly suppressed proliferation and the cells had produced higher amounts of aggrecan, characteristic of the extracellular matrix of hyaline cartilage. In relation to the PVDF, the biological response to the polarization state was studied in films. The effect of polarization on fibronectin conformation, cell adhesion and proliferation has been studied. It was observed that polarization of a PVDF modifies the conformation of adsorbed fibronectin on the material surface and therefore cell adhesion on the fibronectin-coated substrates. As a consequence, a higher number of cells on the substrate were observed in poled than in non-poled samples. These results open the possibility of developing active substrates for cell culture and tissue engineering. Further investigations on the piezoelectric effect on cell response were performed by evaluating osteoblast growth in poled and non-poled PVDF (non-coated and coated with thin titanium layer to get a more homogeneous charge distribution) under static and dynamic conditions. The polarization and titanium layer modifies the mean roughness of PVDF films surface and therefore also modifies cell adhesion and proliferation on the samples, also, the positively charge of β-PVDF promotes higher adhesion and proliferation on osteoblast. Finally, dynamic culture with MC3T3-E1 cells showed higher cell proliferation on "poled +" β-PVDF. Thus, results reported in this thesis have demonstrated that varying surface electrical charge (when a mechanical solicitation is applied) influences cell response and confirms the interest of electroactive polymers in cell culture and tissue engineering applications.Nas últimas décadas, os biomateriais e a engenharia de tecidos têm sido dos campos interdisciplinares mais dinâmicos e que têm atraído cada vez mais atenção por parte da comunidade científica. Com os avanços realizados em engenharia de tecidos, surgiu a necessidade de estudar e desenvolver uma ampla variedade de biomateriais com diferentes propriedades. Entre os diferentes tipos de materiais, os polímeros têm provado serem uma excelente escolha devido às suas várias vantagens tais como o seu simples processamento, flexibilidade, propriedades físicas e serem facilmente obtidos em diferentes formas. Em particular, os polímeros piezoelétricos têm atraído cada vez mais interesse uma vez que conseguem responder a solicitações elétricas e mecânicas, permitindo assim o estímulo ativo dos tecidos. Além disso, as estruturas poliméricas na forma de micro e nanofibras mostraram ser interessantes para engenharia de tecidos. Neste trabalho, o processamento e a caracterização de dois polímeros piezoelétricos, o poli(L-ácido láctico) (PLLA) e o poli(fluoreto de vinilideno) (PVDF), foram realizados com o objetivo de serem utilizados para aplicações de engenharia de tecidos. O processamento foi realizado sob a forma de filmes e fibras. A morfologia das fibras de PVDF e PLLA foi controlada pela variação dos parâmetros de processamento tais como a tensão aplicada, o fluxo e o coletor. Em relação às fibras de PVDF, os parâmetros do processamento mostraram influenciar a fração de fase entre 50% e 85% e o diâmetro das fibras desde algumas centenas de nanómetros até micrómetros. Em relação às fibras de PLLA, a cristalinidade pode ser alterada de 0%, isto é, fibras amorfas, até 50%, através de um tratamento térmico. O diâmetro das fibras de PLLA pode ainda ser reduzido através da introdução do polímero poli(óxido de etileno) (PEO). Desta forma, as membranas foram preparadas por electrospinning através de uma solução de PLLAPEO com diâmetros de fibras desde micrómetros até algumas centenas de nanómetros. A degradação do PLLA também foi estudada e verificou-se que a degradação até 20 semanas das amostras numa solução tampão de fosfato (PBS - phosphate buffer solution) produz uma ligeira diminuição de peso na amostra. As propriedades locais das fibras individuais de PLLA e PVDF foram estudadas por microscopia de força piezoelétrica (PFM) e a resposta piezoelétrica para ambos os polímeros foi verificada. Além disso, a resposta biológica das membranas de PLLA e PVDF foi também investigada. No caso das membranas de PLLA, os condrócitos humanos foram utilizados e verificou-se que a sua proliferação, aquando cultivados nos substratos de monocamada, é igual tanto para as membranas amorfas de fibras alinhadas como para as nãoalinhadas. No entanto, a taxa de diferenciação parece ser maior nos substratos amorfos de fibras não-alinhadas. Além disso, a cristalização dos substratos amorfos de fibras alinhadas demonstraram uma supressão da proliferação, sendo que as células produziram elevadas quantidades de agrecano, característica da matriz extracelular da cartilagem hialina. Em relação ao PVDF, a resposta biológica relativamente ao estado de polarização foi estudada em filmes. O efeito da polarização na conformação da fibronectina, adesão e proliferação celular foi estudado. Verificou-se que a polarização do PVDF tem influência na conformação da fibronectina adsorvida na superfície do material e, por conseguinte, na adesão de células em substratos revestidos com fibronectina. Como consequência, foi observado um maior número de células nos substratos polarizados relativamente aos não-polarizados. Estes resultados abrem a possibilidade de desenvolver substratos ativos para cultivo celular e para engenharia de tecidos. Outras investigações sobre o efeito piezoelétrico na resposta celular foram realizadas sob condições estáticas e dinâmicas, através da avaliação do crescimento de osteoblastos em filmes de PVDF polarizados e não-polarizados (não revestidos e revestidos com uma camada fina de titânio para obter uma distribuição mais homogénea de carga). Além disso, verificou-se que a camada de polarização e de titânio modificam a rugosidade média da superfície dos filmes de PVDF e, portanto, também modificam a adesão e proliferação celular. Observou-se ainda que a carga positiva dos filmes - PVDF promove uma maior adesão e proliferação de osteoblastos. Finalmente, um estudo dinâmico realizado com as células MC3T3-E1 mostrou uma maior proliferação celular nos filmes β-PVDF com polarização positiva. Assim, os resultados observados neste trabalho demonstraram que a variação da carga elétrica na superfície (quando é aplicada uma solicitação mecânica) influencia a resposta celular e confirma o interesse dos polímeros eletroativos para cultivos celulares e aplicações em engenharia de tecidos