Characterization of non-conventional yeasts under hyperbaric conditions : cellular response to oxidative stress

Tese de doutoramento em Chemical and Biological EngineeringProviding an adequate oxygen supply is critical to the growth and maintenance of most aerobic microbial cultures used in biotechnological processes. Oxygen mass transfer from gas phase to the culture medium is often a major growth limiting factor because of oxygen´s low solubility in an aqueous solution. Thus, ensuring adequate oxygen supply to submerged cultures in bioreactors is not trivial. The use of increased air pressure as a way of improving oxygen mass transfer from gas phase to liquid phase has been developed by some authors. However, the effect of reactor pressurization must be considered on cellular growth and metabolism. The increase of oxygen partial pressure could result in reactive oxygen species (ROS) formation and lead to an oxidative environment to the cells. As the effect of increased air and oxygen pressure is strongly dependent of the cell type, species and strains, due to their different abilities of cellular response to possible oxidative stress that can arise, this thesis is focused on the study the behavior of non-conventional yeasts under hyperbaric air. In spite of the well-known importance of Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris in several biotechnological processes, few studies are available on the application of air pressure increase for the cultivation of these yeasts. This work was started with the study of the oxygen mass transfer phenomenon from gas phase to the medium in a lab-scale pressurized bioreactor. The influence of operation parameters (aeration and stirring rates and increased air pressure up to 5 bar) on oxygen transfer rate (OTR) was analyzed. An empirical correlation for the prediction of the volumetric oxygen mass transfer coefficient (kLa) as a function of air pressure, power input and superficial gas velocity was attempted. The results demonstrated that the increased air pressure is valuable option for OTR enhancement in bioreactors, competing favorable with raising stirring and aeration rates, which can cause cell damage by shear stress. Yeast cells exposed to adverse conditions employ a number of defense mechanisms to respond effectively to the stress effects of reactive oxygen species. The cellular response of Y. lipolytica W29 and P. pastoris CBS 2612 to the exposure to the ROS-inducing agents paraquat (1 mM), hydrogen peroxide (50 mM) and increased air pressure (1 bar and 5 bar) was analyzed. For both strains the cellular viability loss and lipid peroxidation was lower for the cells exposed to increased air pressure than for those exposed to chemical oxidants. Under superoxide stress (paraquat and air pressure), the SOD induction was the main observed mechanism, whereas the hydrogen peroxide was the most efficient inducer of catalase. The results suggested that Y. lipolytica have a more potent antioxidant system than P. pastoris. Batch cultivations of Y. lipolytica W29 under air pressures up to 6 bar were performed to investigate whether increasing air pressure may lead to increasing biomass yields, without giving raise to oxidative stress. The levels of antioxidant enzymes induced were also monitored. Cell growth was strongly enhanced by the pressure raise, since 5- and 3.4-fold improvement in the biomass production and in specific growth rate, respectively, were observed under 6 bar. An increase of the SOD specific activity at 6 bar of 53.4-fold was obtained compared with the experiments under 1 bar. Moreover, the influence of a pre-adaptation phase of cells to hyperbaric conditions on the lipase production by Y. lipolytica cells was investigated. The extracellular lipase activity increased 96% using a 5 bar air pressure instead of air at 1 bar pressure during the enzyme production phase. These results demonstrated that air pressure increase in bioreactors is an effective way for the enhancement of cell mass and enzyme productivity in bioprocesses involving Y. lipolytica cultures. P. pastoris CBS 2612 behavior under air pressures of 1 bar, 3 bar and 5 bar in culture media of glycerol (pure and crude) and methanol was studied. Generally, an enhancement on cellular growth, for all carbon sources, was achieved with the raise of air pressure and for batch and fed-batch processes with different feeding rate strategies. In batch cultures, 1.4-, 1.2-, and 1.5-fold improvement in biomass production was obtained with the increase of air pressure up to 5 bar, using methanol, pure glycerol, and crude glycerol, respectively. The increase of air pressure up to 5 bar using exponential feeding rate led to a 1.4-fold improvement in biomass yield per glycerol mass consumed, for pure and crude glycerol. The results show the possibility of improving cell mass production of P. pastoris under moderate air pressure, using low cost carbon sources. P. pastoris GS115/pPICZ/lacZ (Mut+), expressing intracellular β-galactosidase, and P. pastoris KM71H/pPICZαA/frutalin (MutS), expressing extracellular frutalin, were used to investigate the effect of increased air pressure on yeast growth and heterologous protein expression. The increase of air pressure up to 5 bar had a small effect on biomass production, but led to a 9-fold improvement in β-galactosidase specific activity compared to 1 bar. The recombinant frutalin secretion was enhanced by the increased air pressure up to 5 bar and the protease specific activity reached was 2.4 times lower than that obtained at atmospheric pressure in baffled flasks.Um dos pontos críticos de processos biotecnológicos consiste no fornecimento de oxigénio suficiente para o crescimento e manutenção das culturas microbianas aeróbias. A velocidade de transferência de oxigénio do gás para o meio de cultura é normalmente um fator limitante do crescimento, devido à baixa solubilidade do oxigénio em soluções aquosas. Assim, garantir o adequado aprovisionamento de oxigénio a culturas submersas num bioreator não é uma tarefa menosprezável. São poucos os investigadores que têm recorrido ao aumento da pressão de ar como forma de melhorar a transferência de oxigénio da fase gasosa para a fase líquida. Neste caso, o efeito da pressurização do reator no crescimento e metabolismo celular deve ser tido em consideração. Além disso, o aumento da pressão parcial do oxigénio pode resultar na formação de espécies reativas de oxigénio e originar um ambiente oxidativo para as células. Uma vez que o efeito do aumento da pressão de ar e de oxigénio depende das espécies e estirpes, devido à diferente capacidade de resposta ao stresse oxidativo, esta tese foca-se no estudo da resposta celular de leveduras não-convencionais ao ar hiperbárico. Apesar da reconhecida importância das espécies Yarrowia lipolytica e Pichia pastoris em muitos processos biotecnológicos, são poucos os estudos sobre a aplicação do aumento da pressão de ar na cultura destas leveduras. Este trabalho começou com o estudo da taxa de transferência de oxigénio da fase gasosa para o meio líquido num reator pressurizado, à escala laboratorial. Foi analisada a influência de parâmetros operacionais (taxa de arejamento e de agitação e aumento da pressão de ar até 5 bar) na taxa de transferência de oxigénio (OTR). Obteve-se uma correlação empírica do coeficiente volumétrico de transferência de oxigénio (kLa) em função da pressão de ar, da potência de agitação e da velocidade superficial do gás. Os resultados demonstraram que o aumento da pressão de ar é uma opção viável para o incremento de OTR nos bioreatores, em alternativa ao aumento da taxa de arejamento e de agitação, que podem causar stresse hidrodinâmico às células. As células de levedura, quando expostas a condições adversas, desenvolvem um sistema de defesa contra os efeitos causados pelas espécies reativas de oxigénio. Assim, foi analisada a resposta celular das estirpes Y. lipolytica W29 e P. pastoris CBS 2612 à exposição aos agentes indutores de espécies reativas de oxigénio paraquat (1 mM), peróxido de hidrogénio (50 mM) e pressão total de ar (1 bar e 5 bar). Em ambas as estirpes, a perda de viabilidade e a peroxidação lipídica foram menores nas células expostas ao aumento da pressão de ar do que nas expostas aos oxidantes químicos. Em ambiente de stresse provocado pelo ião superóxido (paraquat e pressão de ar), o mecanismo de defesa mais observado foi a indução de SOD, enquanto o peróxido de hidrogénio foi o maior indutor da catalase. Os resultados sugerem que a estirpe Y. lipolytica tem um sistema antioxidante mais eficaz que a estirpe P. pastoris. Com o objectivo de investigar se o aumento da pressão de ar podia conduzir a um incremento no rendimento em biomassa, sem originar stresse oxidativo, foram realizados ensaios em modo batch de Y. lipolytica W29 a valores de pressão total de ar até 6 bar. Foi igualmente avaliada a capacidade da levedura em induzir a expressão de enzimas antioxidantes. O crescimento celular foi consideravelmente beneficiado com o aumento da pressão de ar, uma vez que a produção de biomassa e a taxa específica de crescimento aumentaram 5 e 3.4 vezes, respectivamente, no ensaio realizado a 6 bar. A atividade específica da enzima SOD obtida no ensaio a 6 bar foi 53.4 vezes maior do que a alcançada a 1 bar. Foi também analisada a influência de uma fase de pré-adaptação das células às condições hiperbáricas na produção de lipase por Y. lipolytica. A atividade da lipase extracelular aumentou 96% com a aplicação de uma pressão de ar igual a 5 bar, comparativamente ao ensaio realizado a 1 bar, durante a fase de produção da enzima. Estes resultados demonstraram que o aumento da pressão total de ar é uma forma eficaz de aumentar a produtividade em biomassa e em enzima SOD em bioprocessos que utilizem a levedura Y. lipolytica. Foi estudado o comportamento da estirpe P. pastoris CBS 2612 em meios de glicerol (puro e bruto) e metanol, com valores de pressão iguais a 1 bar, 3 bar e 5 bar. De uma maneira geral, foi observado um incremento do crescimento celular com o aumento da pressão de ar, em todas as fontes de carbono e em processos em modo batch e fed-batch com 2 estratégias de alimentação diferentes. Nas culturas em modo batch usando metanol, glicerol puro e glicerol bruto, obtiveram-se aumentos de 1.4, 1.2 e 1.5 vezes, respectivamente, na produção de biomassa com a pressão de 5 bar. No processo fed-batch com alimentação exponencial, o rendimento em biomassa por massa de glicerol consumido (puro e bruto) aumentou 1.4 vezes com o uso de pressão de ar igual a 5 bar. Os resultados demonstram a possibilidade de aumentar a produção de biomassa de P. pastoris sob pressão de ar moderada, usando fontes de carbono de baixo custo. A estirpe P. pastoris GS115/pPICZ/lacZ (Mut+), que expressa β-galactosidase intracelular, e a estirpe KM71H/pPICZαA/frutalina (MutS), que expressa frutalina extracelular, foram usadas com o intuito de estudar o efeito do aumento da pressão de ar no crescimento destas estirpes e na expressão de proteínas heterólogas. O aumento da pressão total de ar até 5 bar não teve um efeito significativo no crescimento celular destas estirpes, mas conduziu a um incremento de 9 vezes na actividade específica da enzima β- galactosidase, comparativamente à obtida a 1 bar. A expressão de frutalina também aumentou a 5 bar e a actividade específica de protease obtida foi 2.4 vezes inferior à obtida nos ensaios em matraz (pressão atmosférica