Contributions to the study of Vitis vinifera defence mechanisms against esca

Esca is a destructive disease of complex aetiology affecting grapevines worldwide and leading to great economic losses in viticulture. In the Vinho Verde Demarcated Region (North of Portugal), esca and young grapevine decline has been leading to important losses in wine production. The disease is widespread all over the region affecting all varieties of Vinho Verde grapevines, both old and young plants. To study the putative response of Vitis vinifera to esca-related fungi a laboratory model was established, using cells suspension cultures of leaf explants of V. vinifera cv. Vinhão. These suspensions were elicited with an extract of the escarelated fungus Phaeomoniella chlamydospora and several defence mechanisms were studied. Elicitation of cell cultures with the fungal extract led to an increased phenolic production, including the de novo production of the viniferin type compounds e- viniferin-2-glucoside, e- viniferin-glucoside and a polymer of two e- viniferin molecules. The antifungal activity of viniferins has been described in the literature. Also, the effect of the signalling molecules salicylic acid and methyl jasmonate in the defence response was analysed. Methyl jasmonate led to an increase of stilbenic and anthocyanin production, including the stimulation of the de novo production of the same viniferin type compounds as fungal elicitation. Early defence mechanisms, namely oxidative response, occurring in cells suspension cultures after fungal extract elicitation were also studied. The presence of a biphasic oxidative burst, typical of incompatible interactions, induced by fungal elicitation was shown. The influence of priming with the phytohormones salicylic acid and methyl jasmonate in the oxidative burst was also analysed. Although ROS accumulation seems to be potentiated in the first phase of thrburst by salicylic acid priming, priming with both salicylic acid and methyl jasmonate seems to be obstructive to ROS accumulation during the second phase of the oxidative burst. When studying the fungal induced biphasic oxidative burst using a calcium chelator and several calcium channel blockers, results indicated that oxidative response is dependent on calcium availability and that the specific channel types from which calcium influx is originated are also important to induce oxidative burst. Cells suspension cultures were also used to study the putative roles of NADPH oxidase, catalase and peroxidase enzymes in the oxidative burst. Results indicate that NADPH oxidase is the primary ROS producer in the oxidative burst; also, early catalase activity does not seem to be altered by fungal elicitation, while peroxidase might play a role in the second phase of the burst of the oxidative response. Further results also indicate that calcium availability is necessary for NADPH oxidase activation. In addition, the ability of fungal elicitation to induce defence-related genes expression in cells suspension cultures was studied. Increased expression of genes encoding pathogenesis-related proteins (PR-6, PR-10, GLUC, CH3), and enzymes involved in the octadecanoid (LOX) and phenylpropanoid (PAL, STSY) pathways was shown. Overall, these results indicate that V. vinifera cv. Vinhão cells suspension cultures can be an important tool to study esca, since they allow to selectively study host defence response against esca-related fungi, without interference of external factors, leading to reliable results. Field esca-affected material was also studied. The phenolic content of diseased, apparently healthy and healthy leaves of V. vinifera cv. Alvarinho was analysed. The total phenolic content was shown to be increased in diseased and apparently healthy leaves; furthermore, the phenolic content seemed to increase linearly from healthy to diseased leaves, with apparently healthy leaves showing an intermediate amount. Application of a PCA to HPLC data clearly separated diseased from healthy leaves (with apparently healthy leaves clustered in a medial position) and indicated the most important metabolites contributing to that difference. Of those, one metabolite was selected and identified as Kaempferol-3-glucoside. This compound was shown to be increased in diseased and apparently healthy leaves, increasing in a similar manner as that described above for total phenolics. In addition to phenolic content, the overall metabolic response towards esca was studied using NMR spectroscopy. Besides a huge increase in the phenolic compounds in diseased leaves, a decrease of carbohydrates was also detected, suggesting that diseased leaves are rerouting carbon and energy from primary to secondary metabolism. Methanol, alanine and GABA amounts were also shown to be increased in diseased leaves. Overall, these results indicate that V. vinifera cv. Alvarinho mounts a defence response towards esca, in spite of its recognized susceptibility to the disease.A esca é uma doença destrutiva de etiologia complexa que afecta videiras em todo o mundo e leva a graves prejuizos na viticultura. Na Região Demarcada dos Vinhos Verdes (Norte de Portugal), a esca e o declínio de videiras jovens tem levado a perdas importantes na produção vinícola. A doença encontra-se espalhada por toda a região, apresentando-se em todas as castas de Vinho Verde e afectando tanto videiras adultas como jovens. Com o objectivo de estudar a existência de uma resposta de Vitis vinifera contra fungos associados à esca, criou-se um modelo laborarial a partir de explantes foliares de V. vinifera cv. Vinhão, estabelecendo-se culturas de células em suspensão. Estas suspensões foram eliciadas com um extracto do fungo Phaeomoniella chlamydospora (associado à esca) e vários mecanismos de defesa foram estudados. A eliciação das culturas de células com um extracto do fungo levou ao aumento da produção fenólica, incluindo a produção de novo dos compostos tipo viniferina: e-viniferina-2-glucósido, e-viniferina-glucósido e um polímero de duas moléculas de e-viniferina. A actividade antifúngica das viniferinas já foi descrita na literatura. Foi analisado o efeito das moléculas sinalizadoras ácido salicílico e metiljasmonato nesta resposta de defesa. O metiljasmonato induziu o aumento da produção de compostos stilbénicos e antocianinas; inclusivamente estimulou a produção de novo dos mesmos compostos tipo viniferina induzidos pela eliciação fúngica. Também foram estudados mecanismos de defesa precoces, nomeadamente resposta oxidativa, que ocorrem nas suspensões celulares após eliciação com o extracto fúngico. Foi demonstrada a presença de um burst oxidativo bifásico, típico de interacções incompatíveis, induzido pela eliciação com fungo. A influência da indução com as fitohormonas ácido salicílico e metiljasmonato no burst oxidativo foi analisada. Apesar da acumulação de espécies reactivas de oxigénio parecer ser potenciada na primeira fase do burst pela indução com ácido salicílico, tanto a indução com este como com metiljasmonato parece obstruir a acumulação de espécies reactivas de oxigénio durante a segunda fase do burst oxidativo. O uso um quelador de cálcio e vários bloqueadores de canais de cálcio na análise da resposta oxidativa induzida pela eliciação fúngica, indicou que o burst oxidativo depende da disponibilidade de cálcio e que os tipos de canais através dos quais é originado o influxo de cálcio também são importantes para induzir a resposta oxidativa. Também se estudaram nas culturas de células em suspensão as possiveis funções das enzimas NADPH oxidase, catalase e peroxidase no burst oxidativo. Os resultados indicaram que a NADPH oxidase é a fonte primária de espécies reactivas de oxigénio na resposta oxidativa; por outro lado, a actividade da catalase não pareceu ser alterada pela eliciação fúngica enquanto a peroxidase parece poder desempenhar um papel na segunda fase do burst oxidativo. Os resultados também sugerem que a disponibilidade de cálcio é necessária para a activação da NADPH oxidase. Adicionalmente, foi estudada a capacidade da eliciação fúngica induzir a expressão de genes associados à defesa nas culturas de células em suspensão. Os resultados revelaram uma expressão aumentada dos genes que codificam proteínas relacionadas com a patogénese (PR-6, PR-10, GLUC, CH3) e enzimas envolvidas nas vias octadecanoica (LOX) e fenilpropanoide (PAL, STSY). No geral, estes resultados indicam que as culturas de células de V. vinifera cv. Vinhão podem ser uma ferramenta importante para estudar a esca, uma vez que permitem analisar selectivamente a resposta de defesa do hospedeiro contra fungos associados à esca, sem interferência de factores externos e levando a resultados fidedignos. Também foi estudado material de campo afectado pela esca. O conteúdo fenólico de folhas doentes, aparentemente sãs e sãs de V. vinifera cv. Alvarinho foi analisado. Foi demonstrado que o conteúdo fenólico total se encontra aumentado nas folhas doentes e aparentemente sãs, e que o conteúdo fenólico parece aumentar linearmente das folhas sãs para as doentes, com as folhas aparentemente sãs mostrando uma quantidade intermédia. A aplicação de uma PCA aos dados de HPLC separou claramente as folhas sãs das doentes (com as folhas aparentemente sãs agrupadas numa posição medial) e indicou os metabolitos mais importantes que contribuem para essa diferença. Desses metabolitos, um foi seleccionado e identificado como kaempferol-3-glucósido. Este composto mostrou-se aumentado nas folhas doentes e aparentemente sãs, aumentando de um modo similar ao descrito para os fenólicos totais. Além do conteúdo fenólico, a resposta metabólica geral contra a esca foi estudada usando espectroscopia RMN. Além de um grande aumento dos compostos fenólicos nas folhas doentes também foi detectada uma diminuição dos carbohidratos, sugerindo que as folhas doentes reencaminham o carbono e energia do metabolismo primário para o secundário. Nas folhas doentes, também foi detectado um aumento das quantidades de metanol, alanina e GABA. No geral, estes resultados indicam que V. vinifera cv. Alvarinho monta uma resposta de defesa contra a esca, apesar da sua reconhecida susceptibilidade à doença.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT