C-C-Hydrolases in biotransformations : organic solvent tolerance, stereopreference and applications

Die Arbeit beschäftigt sich mit Anwendung von Hydrolasen für Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, speziell ?-Diketon-Hydrolasen, für die organische Synthesechemie. C-C Bindungs-Hydrolasen spalten hydrolytisch ausgewählte Ketosubstrate. Der Hauptteil der Arbeit lag auf einer ?-Diketon-Hydrolase nämlich der ?6-Oxo Camphor Hydrolase? (OCH) aus Rhodococcus sp. Diese katalysiert eine Retro-Claisen-Kondensation von nicht-enolisierbaren, prochiralen, bizyklischen 1,3-Diketonen was zur Bildung eines einzigen Enantiomers einer Ketosäure führt. In der Studie wurde gezeigt, dass OCH eine hohe Stabilität in verschiedenen organischen Lösungsmitteln zeigt und bis zu einem gewissen Grad thermostabil ist. Diese Lösungsmitteltoleranz erlaubte es, dieses Enzym mit einer simultanen Lipasen-katalysierten Veresterung zu kombinieren und so Methyl (3-oxocyclohexyl)acetate in optisch reiner Form im Ein-Topf-System herzustellen. Die Keto-Gruppe des Produkts wurde in einem weitern Schritt mittels formaler reduktiver asymmetrischer bioaminierung mit ?-Transaminasen in ein Diastereomer übergeführt.Die OCH ist (S)-selektiv, jedoch ist kein (R)-selektives Enzym bekannt. Durch Mutagenese von Aminosäuren im aktiven Zentrum wurde versucht die Aminosäuren zu identifizieren die für die Stereopräferenz verantwortlich sind. Weiters wurden Mikroorganismen getestet um gegenläufige Stereopräferenz zu finden. Die Ergebnisse zeigten, dass die (R)-Präferenze tatsächlich auch in der Natur auftritt.Zusätzlich zu den ?-Diketon-Hydrolasen wurden zwei Friedel-Crafts Hydrolasen, nämlich die 2,4-Diacetylphloroglucinol-Hydrolase aus Pseudomonas fluorescens und die Phloretin-Hydrolase aus Eubacterium ramulus untersucht. Aufgrund der Toleranz aller Enzyme gegenüber organischen Lösungsmittel wurde auch alternative Nucleophile zu Wasser untersucht als auch die Möglichkeit der Reaktionsumkehr zur Bildung einer C-C Bindung.In this work, applications of carbon-carbon bond hydrolases, especially ?-diketone hydrolases, in organic synthesis were studied. C-C bond hydrolases are enzymes capable of catalysing the hydrolytic cleavage of selected ketonic substances: ?-Diketone hydrolases, for example, hydrolyse C-C bonds of 1,3-diketones into a ketone and a carboxylate products. The main emphasis of this work was laid on a ?-diketone hydrolase 6-oxo camphor hydrolase (OCH) from Rhodococcus sp. which is a member of the crotonase superfamily and catalyses a reverse Claisen condensation of non-enolisable, prochiral 1,3-diketones yielding a keto acid product as a single enantiomer. In our work, OCH was shown to have a remarkable stability towards a variety of organic solvents and to be moderately thermostable. The stability and activity of OCH in organic solvents allowed the combination of the OCH catalysed hydrolysis with a simultaneous lipase catalysed esterification for the synthesis of methyl (3-oxocyclohexyl)acetate in an enantiopure form. This process was further utilized in combination with a reductive amination catalysed by ?-transaminases.OCH is a strictly (S)-selective catalysts for which no stereocomplementary counterpart has been described. Site-directed mutagenesis studies were carried out for investigating the structural determinants of the enantioselectivity and stereopreference of this enzyme. Additionally, nature?s diversity was sampled for discovering stereocomplementary hydrolytic activity. The results indicated that (R)-selective C-C-hydrolases exist in nature.In addition to the ?-diketone hydrolases, two Friedel-Crafts hydrolases, 2,4-diacetylphloroglucinol hydrolase from Pseudomonas fluorescens and phloretin hydrolase from Eubacterium ramulus were studied. The organic solvent tolerance of all the C-C-hydrolases prompted the study of alternative nucleophiles as substrates as well as C-C-bond formation studies.by Elina SiirolaZsfassung in dt. und engl. SpracheGraz, Univ., Diss., 2013OeBB(VLID)22441