Identifizierung aktiver und enantioselektiver Hydrolasen für den industriellen Einsatz

Von allen Arten Enzym-katalysierter Reaktionen in der organisch-chemischen Synthese gestaltet sich der Einsatz von Hydrolasen am einfachsten, da diese ein breites Substratspektrum aufweisen, keine Kofaktoren benötigen und eine hohe Stabilität unter Prozessbedingungen besitzen. In der Arbeit wird anhand von Modellverbindungen (sekundären Alkoholen) die Entwicklung und Validierung von Testsystemen aufgezeigt, die es ermöglichen, aus dem stetig wachsenden Angebot kommerziell erhältlicher Biokatalysatoren schnell und zuverlässig aktive und enantioselektive Hydrolasen zu identifizieren. Die Charakterisierung ausgewählter Enzyme unter technischen Bedingungen zeigt oft, dass deren Eigenschaften für die Etablierung rentabler Prozesse nur unzureichend sind. Durch Substrat- bzw. Medien-Engineering, Immobilisierung und Optimierung der Enzyme durch gerichtete Evolution kann die Effizienz der biokatalytischen Umsetzungen insbesonders hinsichtlich der Stereoselektivität gesteigert werden. Die Generierung einer Mutantenbibliothek erfolgt nach der klassischen Methode der gerichteten Evolution durch error-prone PCR. Bei der Durchmusterung der Mutantenbibliothek nach stereoselektiveren Enzymvarianten kommt ein neu entwickeltes Hochdurchsatz-Testsystem zum Einsatz. Das Testformat basiert dabei auf der Hydrolase-katalysierten Spaltung von Acetat-Estern mit nachfolgender Bestimmung der freigesetzten Essigsäure in einer gekoppelten enzymatischen Nachweisreaktion.Of all the types of enzyme-catalyzed reactions in organic synthesis, hydrolytic transformations are the easiest to perform. Hydrolases accept a broad range of substrates, exhibit high stability and cofactors are not required. Since the number of commercially available biocatalysts is raising steadily, in this thesis model substrates (secondary alcohols) are used to develop and evaluate assay systems for the fast and reliable identification of active and enantioselective Hydrolases. Under technical conditions the characterization of selected enzymes often shows, that their properties are not satisfying for the generation of profitable processes. By substrate- and medium-engineering, respectively, immobilization and the improvement of an enzyme by directed evolution it is possible to increase the effectiveness of a biocatalytic process, especially with respect to the enantioselectivity. The generation of a mutant library is performed by the classical method of directed evolution by error-prone PCR. For the identification of more stereoselective enzyme variants a new high-throughput assay system is used to screen the mutant library. The assay format is based on the Hydrolase-catalyzed cleavage of acetates with subsequent determination of the released acetic acid by a cascade of enzymatic reactions