Untersuchungen zum Verständnis der Beziehung von Enzymen mit α/β-Hydrolasefaltung: Generierung von Epoxidhydrolaseaktivität in eine Esterase

Enzyme sind bekannt als Biokatalysatoren, die spezifisch für ein oder wenige Substrate und ihre zu katalysierende Reaktion sind. Die Fähigkeit einiger Enzyme, mehr als nur eine bestimmte chemische Umsetzung zu katalysieren, bezeichnet man als Promiskuität. Einige Enzyme verfügen über ein breites Substratspektrum und können selbst strukturell verschiedene Substrate umsetzen. Man spricht hierbei von der Substratpromiskuität (substrate promiscuity) der Enzyme. Eine weitere Klasse der Promiskuität wird als Konditionspromiskuität (condition promiscuity) bezeichnet. Hierzu zählen Enzyme, die auch bei nicht-natürlichen Reaktionsbedingungen wie hohen Temperaturen, extremen pH-Werten oder in wasserfreiem Medium katalytische Aktivität aufweisen. Die katalytische Promiskuität (catalytic promiscuity) bildet die dritte Gruppe der Enzympromiskuität. Enzyme, die über diese Art der Promiskuität verfügen, zeichnen sich durch eine breite Reaktionsspezifität bei der Katalyse alternativer Reaktionen aus. Zudem lehren uns die Strukturen von über 30.000 Proteinen, dass die Natur nur von einem limitierten Repertoire von Proteingerüsten Gebrauch gemacht hat, um dennoch eine Vielzahl an verschiedensten Reaktionen herbeizuführen. Die Vielfältigkeit der Proteingerüste ist auf einige wenige Vorfahren zurückzuführen, deren Gerüst als Basis zur Generierung von Familien und Superfamilien diente. Die Überreste dieses Prozesses spiegeln sich in den ähnlichen Strukturen und katalytischen Resten der Familienmitglieder wieder. Über die Millionen von Jahren der Evolution haben sich jedoch die Sequenzähnlichkeiten der Mitglieder einer Familie stark verändert. Durch die Untersuchung der Beziehungen von Enzymen mit α/β-Hydrolasefaltung am Beispiel der Generierung von Epoxidhydrolaseaktivität in das Proteingerüst der Pseudomonas fluorescens Esterase (PFE) sollte die verwandtschaftliche Beziehung beider Enzyme näher dargestellt werden. Mit Hilfe der Methoden der positionsgerichteten Mutagenese und der gerichteten Evolution war es möglich eine Vielzahl von Mutanten zu kreieren. Zur Durchmusterung der Mutantenbliotheken kam sowohl ein neu entwickelter Agarplatten-Assay, als auch ein optimiertes Hochdurchsatz-Testsystem zum Einsatz. Mittels dieser Testformate konnten Mutanten der PFE identifiziert werden, die aktiv gegenüber Epoxiden sind. Des Weiteren erfolgte die genaue Charakterisierung der generierten Varianten.The ability of enzymes to catalyse more than one specific reaction is constitute as promiscuity. Some enzymes accept a broad range of substrates. This property of enzymes is called substrate promiscuity. Enzymes, which show catalytic activity under non-natural conditions like high temperatures, extreme pH or non-aqueous medium exhibit condition promiscuity. The catalytic promiscuity defines the last group of enzyme promiscuity. These enzymes are characterised by catalysing alternative reactions. Besides, the structures of more than 30,000 proteins taught us that nature made use of a rather limited repertoire of core structural platforms, or “scaffolds” (on the order of a few thousand), to mediate an amazingly large diversity of functions. This diversity had presumably emerged from a small number of progenitor proteins, each with a different basic scaffold, thus creating enzyme families and superfamilies. The vestiges of this process are the scaffold and active-site architecture or key catalytic residues shared by all family members. Esterases and epoxide hydrolases adopt an a/b-hydrolase fold, but differ in their substrate specificity. The structural relation between these two enzymes should be characterised by converting the Pseudomonas fluorescens esterase (PFE) into an epoxide hydrolase. The generation of mutant libraries is performed by classical method of site-directed mutagenesis followed by directed evolution methods. The libraries were screened with a new developed agar-plate assay and an optimized high-throughput assay system. By using these assay formats it was possible to identify variants of PFE that are active against epoxides