Untersuchungen zur Erweiterung der Substratspezifität von Carboxylester-Hydrolasen

Carboxylester-Hydrolasen gehören zu den Enzymen, die durch hohe Lösungsmitteltolereanz, gute Lagerstabilität und ein breites Substratspektrum, am häufigsten in der Biokatalyse eingesetzt werden. Allerdings akzeptieren sie im Gegensatz zu Estern primärer und sekundärer Alkohole nur in Ausnahmefällen Ester tertiärer Alkohole als Substrate. In der Arbeit werden Wege untersucht mittels Gerichteter Evolution und rationalem Protein Design, Esterasevarianten zu generieren die in der Lage sind diese Substrate mit guten Enantioselektivitäten umzusetzen. Unter Verwendung von Methoden der Zufallsmutagenese werden große Enzymbibliotheken aufgebaut und mit einem mikrotiterplatten basierendem Assays-system auf neu generierte Aktivitäten untersucht. Mittels molecular modeling, werden Positionen vorhergesagt, an den gezielt Mutationen eingeführt werden können um eine erhöhte Enantioselektivität zu erreichen.Carboxylester hydrolases are among the enzymes used most frequently in biocatalysis. They show good solvent and storage stability and accept a broad range of substrates. While they hydrolyze esters of primary and secondary alcohols most of them are not able to convert esters of tertiary alcohols. In this thesis methods are examined to generate esterase variants by directed evolution and rational protein design which are able to hydrolyze those substrates with high enantioselectivity. Large enzyme libraries of random mutants are created and screened on new activities with a microtiterplate based assay system. Utilizing molecular modeling techniques positions were predicted to enhance enantioselectivity by directed mutagenesis