Study of the pulsed electric fields and high pressure nonthermal processes for yeast biomass valorization via biofunctional ingredients applicable in food systems

The cellular composition of S. cerevisiae places the microorganism at the center of research for the extraction of bioactive compounds. The production of biomass of the microorganism in large quantities and low cost both primarily and as a by-product of other processes, such as brewing, makes it an attractive source of such ingredients. The process of autolysis is based on the action of endogenous lytic enzymes of the microorganism under controlled conditions of pH and temperature to produce yeast extracts, ingredients used as natural food additives to enhance the taste, owing to the free amino acids and peptides they contain. Autolysis is preferred over other processes (enzyme hydrolysis, salt plasmolysis, inorganic acid hydrolysis), due to the low cost and simple equipment required. The main obstacle in the process is the low permeability of the cell, which leads to a deceleration of the process, with a duration exceeding 24 h. At the same time, the process leads to the production of a large amount of solid residues rich in β-glucans, which are usually discarded or used for the production of animal feed. Processes that cause an increase in cell permeability can contribute to the acceleration of autolysis and at the same time contribute to the utilization of the solid residue. Furthermore, increased cell permeability can improve the extraction of endogenous cell proteases but also make the cells suitable carriers for the encapsulation of bioactive compounds. The aim of this thesis was to study the application of innovative, non-thermal processes of Pulsed Electric Fields (PEF), High Pressure (HP) and High Pressure Homogenization (HPH) in the utilization of yeast (Saccharomyces cerevisiae) biomass. The research was focused on the study of the effect of these processes on the improvement of the cell’s autolytic process in terms of the rate and yield of yeast extract production with the simultaneous enrichment of the solid cell residue of the process in β-glucans. At the same time, the effect of HP on the endogenous proteolytic enzymes of the microorganism was studied, as well as the application of the processes as cellular pretreatments to improve the cellular encapsulation of oregano essential oil. The effect of each process on the autolysis (52°C, pH = 5.5) of the cell suspensions was studied in terms of the physicochemical characteristics of the extract produced (concentration of free α-amino nitrogen and proteins, release of total solids, browning index, turbidity) and the insoluble autolysis residue in terms of β-glucan and insoluble protein content. Where possible, the dependence of these characteristics from the autolysis time was mathematically modelled using a first-order exponential model, and the effect of the processing conditions on the autolysis was estimated based on their effect on the equation parameters. The degree of cell rupture caused by each process was assessed based on the cell disintegration index Z which is determined based on the electrical conductivity of the cell suspension and expresses the percentage of cells that become permeable. In the first part of the thesis the effect of PEF on the cell disintegration of S. cerevisiae suspensions was studied with the aim of establishing suitable processing conditions leading to effective cell permeabilization. Initially, a kinetic study of the effect of the process parameters (electric field strength 2-22 kV / cm, number of applied pulses 0-2000) and the cell content of the suspension (1% -10% by weight) on the cell disintegration index was performed. The effect of PEF on the autolysis kinetics of S. cerevisiae suspensions was further studied. The PEF treatment conditions applied (electric field strength 5-20 kV / cm, 0-2000 pulses) were selected based on the effect of the cell disintegration index on the process parameters, in order to study the effect of a range of values of the cell disintegration index (Z=0-1) on autolysis. PEF treatment significantly accelerated the release of α-amino nitrogen, proteins and total solids by 54%, 69% and 60%, respectively, compared to the untreated suspension. The maximum acceleration was achieved for cell disintegration index values greater than 0.5, while it was found that the acceleration of autolysis depends on the cell disintegration index regardless of the combination of electric field strength and number of pulses applied to achieve it.In the next section of the thesis, the effect of PEF treatment on the autolysis of S. cerevisiae cell suspensions in combination with the use of papain, a plant protease used to increase extract yield during autolysis, was studied. The selected conditions led to the achievement of cell disintegration index values in the range Z=0 to Z=0.74). The treatment conditions were combined with the use of papain at a weight concentration of 0.25%. An increase in the intensity of the PEF treatment conditions led to the acceleration of autolysis in terms of all studied physicochemical characteristics of the extract. The total acceleration of autolysis was estimated based on the release kinetics of α-amino nitrogen which is the most important physicochemical characteristic of the extract. Compared to the untreated sample, PEF treatment at 1000 pulses resulted in an overall acceleration of autolysis by 62% with respect to α-amino nitrogen, leading to the production of an extract with 51% w/w protein (52% for the untreated sample), 6.1% w/w α-amino nitrogen (7.5% for the untreated sample) and a browning index of 19.1 (16.5 for the untreated sample). At these treatment conditions, the solid autolysis residue was found to have an increased β-glucan content (by 25% compared to the untreated) and a reduced protein content (by 21% compared to the untreated). Autolysis in the presence of papain accelerated autolysis in combination with an increase in the cell disintegration index (55%-61%) relative to the untreated sample, leading to the production of extracts with similar characteristics. The presence of papain in combination with PEF treatment at 1000 pulses led to further enrichment of the solid residue with β-glucans while reducing its protein content (51% and 31% respectively compared to the untreated sample). However, the presence of papain significantly increased the turbidity of the extract by 3 to 9 times compared to the untreated sample. Next, the effect of High Pressure processing (HP) (200-750 MPa, 0-120 min) on S. cerevisiae cell suspensions, in terms of the cell disintegration index, total proteolytic activity and autolysis, was studied. Increased pressure and processing time led to an increase in the cell disintegration index. The proteolytic activity of the cells increased at pressures of 200 and 400 MPa (up to 1.7 times compared to the untreated sample), while at pressures above 600 MPa inactivation of the proteolytic activity was observed. HP treatment significantly affected autolysis in terms of the measured physicochemical characteristics, at the selected treatment conditions (200, 400, 600 MPa, 0-60 min). At pressures 200 and 400 MPa, HP treatment accelerated autolysis while at a pressure of 600 MPa autolysis was inhibited, despite the high values of cell rupture index, due to the loss of proteolytic activity. Based on the release of α-amino nitrogen, it was found that for treatment at 400 MPa for 16 min, autolysis was accelerated by 61%. At these treatment conditions, the content of the solid residue in β-glucans increased by 37% compared to the untreated sample, while its protein content was reduced by 26%. In this section the effect of HP treatment in combination with different autolysis temperatures (32°C, 42°C and 52°C) on the activity of vacuolar proteases A and B for mechanically disrupted cell suspensions was also studied. At an autolysis temperature of 52°C pressures of 200 and 400 MPa, protease activity increased up to 100% in the first 2-6 h of autolysis relative to the untreated sample. However, autolysis at 32°C and 42°C resulted in loss of protease A activity in the first 6 h of autolysis which recovers after 16 h. The maximum proteolytic activity for both enzymes is obtained for autolysis at 32°C after 16 h, where the activity of protease B is fivefold compared to the initial activity, while protease A recovers to levels comparable to its initial activity. The dependence of the milk clotting capacity on the enzymatic activity of the two proteases of the crude extract was studied by applying HP as a process to achieve different activities for the two proteases. The ability of the crude extracts to coagulate milk was found to be highly dependent on the activity of the two proteases, with the activity of protease A affecting it more significantly than protease B. The lowest clotting time at 50°C achieved was 136 s for the untreated extract (compared to rennet at 2 mg/mL with a clotting time of 148 s at the same temperature).In the last experimental section of the thesis, the effect of PEF, HPH and autolysis on the encapsulation of oregano essential oil in yeast cells was studied. Cells treated with PEF (8.5-17 kV/cm, specific energy 3.2-107 kJ/kg), HPH (800 bar, 4 passes) and autolysis (52°C, pH=5.5 for 8 and 24 h) were studied as encapsulation materials. The encapsulation was performed by mixing the dry cell materials in the presence of oil, water and ethanol (63.8% water, 14.5% oil, 14.5% cell material, 7.2% ethanol) at different temperatures (30°C, 37°C, 45°C, 65°C). The encapsulation kinetics were studied in terms of the encapsulation load and were described mathematically through Fick's 2nd law for diffusion. In the produced cell capsules, the release of oil as a function of water activity at water activity values of 0.53-0.97 and the composition of the encapsulated oil by gas chromatography (GC-MS) were studied. Finally, samples from each cell pretreatment were studied by scanning electron microscopy to assess the effect of each pretreatment on the cellular structures. Both the cell pretreatments studied and the encapsulation temperature were found to have a significant effect on the encapsulation kinetics leading to an increase in the effective diffusion coefficient of up to 260% compared to the untreated sample. The encapsulation load was not significantly affected by the cell pretreatments or the encapsulation temperature, reaching 38%, except for homogenized cells which achieved an encapsulation load of 24.1%. The release of oil from the cells as a function of water activity was found to become significant at a water activity above 0.7, leading to the release of up to 90% of the total encapsulated oil. The results of the present thesis demonstrate the suitability of nonthermal processes for the valorization of S. cerevisiae cell biomass. In addition to significantly accelerating the production of yeast extract, the processes studied contribute to the increase in the content of the autolysis solid residue in β-glucans. At the same time, the increase in cell permeability makes the cells suitable carriers for the encapsulation of bioactive components, providing another possibility for their valorization.Η κυτταρική σύσταση του S. cerevisiae τον τοποθετεί στο επίκεντρο της έρευνας για την παραλαβή βιοδραστικών συστατικών. Η παραγωγή βιομάζας του μικροοργανισμού σε μεγάλες ποσότητες και χαμηλό κόστος τόσο πρωτογενώς όσο και ως παραπροϊόν άλλων διεργασιών, όπως η ζυθοποιία, τον καθιστά ελκυστική πηγή τέτοιων συστατικών. Η διεργασία της αυτόλυσης στηρίζεται στην δράση των ενδογενών λυτικών ενζύμων του μικροοργανισμού υπό ελεγχόμενες συνθήκες pH και θερμοκρασίας για την παραγωγή εκχυλισμάτων μαγιάς, συστατικά που χρησιμοποιούνται ως φυσικά πρόσθετα τροφίμων για την ενίσχυση της γεύσης, χάρη στα ελεύθερα αμινοξέα και πεπτίδια που περιέχουν. Η αυτόλυση προτιμάται σε σχέση με άλλες διεργασίες παραγωγής εκχυλίσματος (ενζυμική υδρόλυση, πλασμόλυση με άλας, υδρόλυση με ανόργανα οξέα), λόγω του χαμηλού κόστους και του απλού εξοπλισμού που απαιτεί. Κύριο εμπόδιο στη διεργασία αποτελεί η χαμηλή διαπερατότητα του κυττάρου, η οποία οδηγεί σε επιβράδυνση της διεργασίας, με διάρκεια που ξεπερνά τις 24 h. Παράλληλα, η διεργασία οδηγεί στην παραγωγή μεγάλης ποσότητας στερεών υπολειμμάτων πλούσιων σε β-γλυκάνες, τα οποία όμως απορρίπτονται ή οδηγούνται στην παραγωγή ζωοτροφών. Διεργασίες που προκαλούν αύξηση της κυτταρικής διαπερατότητας μπορούν να συνεισφέρουν στην επιτάχυνση της αυτόλυσης και ταυτόχρονα να συνεισφέρουν στην αξιοποίηση του στερεού υπολείμματος. Ακόμη, αυξημένη κυτταρική διαπερατότητα μπορεί να βελτιώσει την παραλαβή των ενδογενών πρωτεασών του κυττάρου αλλά και να τα καταστήσει κατάλληλους φορείς για την ενθυλάκωση βιοδραστικών συστατικών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της εφαρμογής των καινοτόμων, μη θερμικών διεργασιών των Παλμικών Ηλεκτρικών Πεδίων (ΠΗΠ), της Υπερυψηλής Πίεσης (ΥΠ) και της Ομογενοποίησης Υψηλής Πίεσης (ΟΥΠ) στην αξιοποίηση βιομάζας κυττάρων του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Οι διεργασίες αυτές αυξάνουν την κυτταρική διαπερατότητα, διατηρώντας ή και ενισχύοντας την ενδογενή ενζυμική ενεργότητα των κυττάρων. Η έρευνα επικεντρώθηκε στη μελέτη της επίδραση των διεργασιών αυτών στην βελτίωση της διεργασίας της αυτόλυσης ως προς τον ρυθμό και την απόδοση εκχυλίσματος μαγιάς με τον ταυτόχρονο εμπλουτισμό του στερεού κυτταρικού υπολείμματος της διεργασίας σε β-γλυκάνες. Παράλληλα μελετήθηκε η επίδραση της ΥΠ στα ενδογενή πρωτεολυτικά ένζυμα του μικροοργανισμού αλλά και η εφαρμογή των διεργασιών ως κυτταρικές προεπεξεργασίες για την βελτίωση της κυτταρικής ενθυλάκωσης αιθερίου ελαίου ρίγανης. Η επίδραση των διεργασιών στην αυτόλυση (52°C, pH=5.5) των κυτταρικών αιωρημάτων μελετήθηκε ως προς τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του παραγόμενου εκχυλίσματος (συγκέντρωση α-αμινικού αζώτου και πρωτεϊνών, απελευθέρωση ολικών στερεών, δείκτης αμαύρωσης, θολότητα) και του στερεού υπολείμματος της αυτόλυσης ως προς την περιεκτικότητα β-γλυκανών και αδιάλυτων πρωτεϊνών. Όπου κατέστη δυνατό, η εξάρτηση των χαρακτηριστικών από τον χρόνο αυτόλυσης περιγράφηκε μαθηματικά με τη χρήση εκθετικού μοντέλου πρώτης τάξης και η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στην αυτόλυση εκτιμήθηκε με βάση την επίδρασή τους στις παραμέτρους της εξίσωσης. Ο βαθμός κυτταρικής διάρρηξης που προκαλείται από κάθε διεργασία εκτιμήθηκε με βάση τον δείκτη κυτταρικής διάρρηξης Z ο οποίος προσδιορίζεται με βάση την ηλεκτρική αγωγιμότητα του κυτταρικού αιωρήματος και εκφράζει το ποσοστό των κυττάρων που υφίστανται διάρρηξη. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση των ΠΗΠ στην κυτταρική διάρρηξη αιωρημάτων S. cerevisiae με στόχο την εύρεση των συνθηκών επεξεργασίας που οδηγούν σε αποτελεσματική διάρρηξη. Αρχικά πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων της διεργασίας (ένταση ηλεκτρικού πεδίου 2-22 kV/cm, αριθμός εφαρμοζόμενων παλμών 0-2000) και της κυτταρικής περιεκτικότητας του αιωρήματος (1%-10% κ.β.) στον δείκτη κυτταρικής διάρρηξης. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση των ΠΗΠ στην κινητική της αυτόλυσης αιωρημάτων S. cerevisiae. Οι συνθήκες επεξεργασίας ΠΗΠ που εφαρμόστηκαν (ένταση ηλεκτρικού πεδίου 5-20 kV/cm, 0-2000 παλμοί) επιλέχθηκαν με βάση τη μελέτη της εξάρτησης του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης από τις παραμέτρους της διεργασίας, ώστε να μελετηθεί η επίδραση εύρους τιμών του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης (Ζ=0-1) στην αυτόλυση. Η εξεργασία με ΠΗΠ επιτάχυνε σημαντικά την απελευθέρωση α-αμινικού αζώτου, πρωτεϊνών και ολικών στερεών κατά 54%, 69% και 60% αντίστοιχα σε σχέση με το ανεπεξέργαστο αιώρημα. Η μέγιστη επιτάχυνση της απελευθέρωσης επιτεύχθηκε για τιμές δείκτη κυτταρικής διάρρηξης μεγαλύτερες από 0.5, ενώ βρέθηκε ότι η επιτάχυνση της αυτόλυσης εξαρτάται από τον δείκτη κυτταρικής διάρρηξης ανεξάρτητα από τον συνδυασμό έντασης ηλεκτρικού πεδίου και αριθμού παλμών με τον οποίο επιτυγχάνεται. Στην επόμενη ενότητα της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση της επεξεργασίας ΠΗΠ (6 kV/cm, 0-1000 παλμοί) στην αυτόλυση κυτταρικών αιωρημάτων S. cerevisiae σε συνδυασμό με την χρήση παπαΐνης, μιας φυτικής πρωτεάσης που έχει χρησιμοποιηθεί για την αύξηση της απόδοσης εκχυλίσματος κατά την αυτόλυση. Οι συνθήκες που επιλέχθηκαν οδήγησαν στην επίτευξη τιμών δείκτη κυτταρικής διάρρηξης στο εύρος Ζ=0 έως και Ζ=0.74). Οι συνθήκες επεξεργασίας συνδυάστηκαν με την χρήση παπαΐνης σε περιεκτικότητα 0.25% κ.β.. Η αύξηση της έντασης των συνθηκών επεξεργασίας ΠΗΠ οδήγησε στην επιτάχυνση της αυτόλυσης ως προς όλα τα μελετούμενα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του εκχυλίσματος. Η συνολική επιτάχυνση της αυτόλυσης εκτιμήθηκε με βάση την κινητική απελευθέρωσης του α-αμινικού αζώτου που αποτελεί το σημαντικότερο φυσικοχημικό χαρακτηριστικό του εκχυλίσματος. Σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα, η επεξεργασία με ΠΗΠ για 1000 παλμούς οδήγησε σε συνολική επιτάχυνση της αυτόλυσης κατά 62% ως προς το α-αμινικό άζωτο, οδηγώντας στην παραγωγή εκχυλίσματος με 51% κ.β. περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες (52% για το ανεπεξέργαστο δείγμα), 6.1% κ.β. περιεκτικότητα σε α-αμινικό άζωτο (7.5% για το ανεπεξέργαστο δείγμα) και δείκτη αμαύρωσης 19.1 (16.5 για το ανεπεξέργαστο δείγμα). Στις συνθήκες αυτές, το στερεό υπόλειμμα της αυτόλυσης βρέθηκε να έχει αυξημένη περιεκτικότητα σε β-γλυκάνες (κατά 25% σε σχέση με το ανεπεξέργαστο) και μειωμένη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες (κατά 21% σε σχέση με το ανεπεξέργαστο). Η αυτόλυση παρουσία παπαΐνης επιτάχυνε την αυτόλυση σε συνδυασμό με αύξηση του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης (55%-61%) σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα, οδηγώντας στην παραγωγή εκχυλισμάτων με παρόμοια χαρακτηριστικά. Η παρουσία παπαΐνης σε συνδυασμό με επεξεργασία ΠΗΠ για 1000 παλμούς οδήγησε σε περαιτέρω εμπλουτισμό του στερεού υπολείμματος σε β-γλυκάνες με παράλληλη μείωση της περιεκτικότητάς του σε πρωτεΐνες (51% και 31% αντίστοιχα σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα). Εντούτοις, η παρουσία παπαΐνης αύξησε σημαντικά τη θολότητα του εκχυλίσματος από 3 έως και 9 φορές σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα. Στην επόμενη ενότητα της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση της διεργασίας της Ομογενοποίησης Υψηλής Πίεσης (ΟΥΠ) (200-800 bar, 1-4 διελεύσεις) στην αυτόλυση κυτταρικών αιωρημάτων S. cerevisiae. Η επεξεργασία με ΟΥΠ οδήγησε στην επιτάχυνση της αυτόλυσης ως προς όλα τα μελετούμενα χαρακτηριστικά, καθώς αύξηση της πίεσης και του αριθμού διελεύσεων οδήγησαν σε αύξηση του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης (Ζ=0.97 στα 800 bar/3 διελεύσεις). Με βάση την κινητική απελευθέρωσης α-αμινικού αζώτου, η επεξεργασία στις εντονότερες συνθήκες (800 bar, 3 διελεύσεις) βρέθηκε ότι επιταχύνει την αυτόλυση κατά 86%, με τα παραγόμενα εκχυλίσματα να εμφανίζουν περιεκτικότητα 8.2% κ.β. σε α-αμινικό άζωτο (6.5% για το ανεπεξέργαστο δείγμα) και 57.0% κ.β. σε πρωτεΐνες (48.3% για το ανεπεξέργαστο δείγμα). Εντούτοις, τα εκχυλίσματα που παράγονται με ΟΥΠ εμφάνισαν υψηλές τιμές θολότητας, έως και 4 φορές αυξημένες σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα. Η επίδραση της ΟΥΠ στην περιεκτικότητα του στερεού υπολείμματος της αυτόλυσης σε β-γλυκάνες και πρωτεΐνες επίσης βρέθηκε να είναι σημαντική. Η περιεκτικότητα β-γλυκανών του στερεού αυξήθηκε με αύξηση του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης αλλά μόνο σε συνδυασμό με την αυτόλυση, επιτυγχάνοντας περιεκτικότητα έως και 78% αυξημένη σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα, για χρόνο αυτόλυσης 8 και 24 h στον μέγιστο δείκτη κυτταρικής διάρρηξης (Ζ=0.97), με παράλληλη μείωση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες κατά 64%. Στην συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της διεργασίας της Υπερυψηλής Πίεσης (ΥΠ) (200-750 MPa, 0-120 min) στα κυτταρικά αιωρήματα S. cerevisiae, ως προς τον δείκτη κυτταρικής διάρρηξης, την ολική πρωτεολυτική ενεργότητα και την αυτόλυση. Αύξηση της πίεσης και του χρόνου επεξεργασίας οδήγησαν σε αύξηση του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης. Η πρωτεολυτική ενεργότητα των κυττάρων αυξήθηκε σε πιέσεις 200 και 400 MPa (έως και 1.7 φορές σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα), ενώ σε πιέσεις άνω των 600 MPa παρατηρήθηκε απενεργοποίηση της πρωτεολυτικής ενεργότητας. Η ΥΠ επηρέασε σημαντικά την αυτόλυση ως προς τα μετρούμενα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά, στις συνθήκες επεξεργασίας που επιλέχθηκαν (200, 400, 600 MPa, 0-60 min). Για πιέσεις επεξεργασίας 200 και 400 MPa, η επεξεργασία με ΥΠ επιτάχυνε την αυτόλυση ενώ σε πίεση επεξεργασίας 600 MPa η αυτόλυση παρεμποδίστηκε, παρά τις υψηλές τιμές δείκτη κυτταρικής διάρρηξης, εξαιτίας της απώλειας της πρωτεολυτικής ενεργότητας. Με βάση την απελευθέρωση α-αμινικού αζώτου, βρέθηκε ότι για επεξεργασία 400 MPa για 16 min, η αυτόλυση επιταχύνθηκε κατά 61%. Παράλληλα στις συνθήκες αυτές, η περιεκτικότητα του στερεού υπολείμματος σε β-γλυκάνες ήταν κατά 37% αυξημένη σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα, ενώ η περιεκτικότητά του σε πρωτεΐνες κατά 26% μειωμένη. Στην ενότητα αυτή μελετήθηκε επίσης η επίδραση της ΥΠ σε συνδυασμό με διαφορετικές θερμοκρασίες αυτόλυσης (32°C, 42°C και 52°C) στην ενεργότητα των κενοτοπικών πρωτεασών Α και Β κατά την αυτόλυση μηχανικά διαρρηγμένων κυττάρων (διάρρηξη με ΟΥΠ). Οι δύο αυτές πρωτεάσες παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην αυτόλυση του κυττάρου. Σε θερμοκρασία αυτόλυσης 52°C πιέσεις 200 και 400 MPa, η ενεργότητα των πρωτεασών αυξήθηκε έως και 100% στις πρώτες 2-6 h της αυτόλυσης σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα. Ωστόσο, αυτόλυση στους 32 και 42°C οδήγησε σε απώλεια της πρωτεάσης Α στις πρώτες 6 h της αυτόλυσης η οποία ανακάμπτει μετά τις 16 h. Η μέγιστη πρωτεολυτική ενεργότητα και για τα δύο ένζυμα παραλαμβάνεται για αυτόλυση στους 32°C μετά τις 16 h, όπου η ενεργότητα της πρωτεάσης Β πενταπλασιάζεται σε σχέση με την αρχική ενεργότητα, ενώ η πρωτεάση Α ανακάμπτει σε επίπεδα συγκρίσιμα με τα αρχικά. Η εξάρτηση του χρόνου πήξης του γάλακτος από την ενζυμική ενεργότητα των δύο πρωτεασών μελετήθηκε με εφαρμογή της ΥΠ ως διεργασία για την επίτευξη διαφορετικών τιμών ενεργότητας για τις δύο πρωτεάσες. Η ικανότητα των ενζυμικών εκχυλισμάτων στην