Ανάκτηση, Χαρακτηρισμός και Μελέτη της Δράσης Αντιοξειδωτικών Συστατικών του Φυτού Majorana syriaca

This study is employed on Majorana Syriaca, an important food-flavouring ingredient grown up in Palestine and middle east, commonly known as Za’atar. The dried herb was brought from the local market of Bethlehem and used for a series of experiments studying intensively its antioxidative effect. In the first series of experiments, the dried leaves of M. syriaca were subjected to successive extractions, using a Soxhlet apparatus, with solvents of increasing polarity, specifically with petroleum ether (P), diethyl ether (D), ethyl acetate (EAc), and ethanol (E), in order to fractionate the components of the plant according to their polarity so as to investigate their activity and facilitate their identification. P was used to extract the less polar compounds including the constituents of the essential oil. The oil-free plant material was then treated with D, a low-polarity solvent for the extraction of low-polarity flavonoid aglycones, and EAc, a medium polarity solvent for the extraction of flavonoids with medium polarity. The extraction with E was performed to collect the residual, polar phenolics. The overall yield was 23% on dry basis, 9.04% obtained by P extraction, 3.40% by D, 4.10% by EAc, and 6.03% by E. The P extract was analyzed according to GS-MS analysis, and the main components were thymol (42.89 %) and carvacrol (42.75 %). The main components of the other successive extracts (D, E, EAc) were detected according to analysis by HPLC-DAD and HPLC–MS. The D extract comprised taxifolin, eriodictyol, and carnosol, while the rosmarinic acid was found in both EAc and E extracts. Apigenin was also detected in the EAc extract, beside other peaks of flavones, flavone glucosides and flavanones. Followingly, the activity of the extracts to scavenge the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH.) was measured, and found that they followed the order D > E > EAc > P. The calculated EC50 values (i.e. the amount of dry extract that reduces DPPH concentration to half) were 1000, 1018, 1422, and 6000 g extract/kg DPPH for the D, E, EAc, and P extracts respectively. the antiradical efficiency in DPPH/methanol was 1000, 1018, 1423 for D, E and EAc respectively. Moreover, the antioxidant activity in corn oil at concentrations of 200, 500 and 1000 ppm was monitored through peroxide value (PV) and conjugated dienes measurements (CD) at accelerated oxidation tests, and revealed that D and E extracts resulted in the highest protection followed by EAc and P extracts. Increasing the concentration from 200 to 500 ppm depressed peroxide formation, while a further increase had no effect, as shows values of CD (i.e in P =0.565± 0.052, 0.451± 0.126, 0.476± 0.011 for 200, 500 and 1000ppm).In the second series of experiments, M. syriaca was subjected to a simplified, one step extraction by ethyl acetate (1-EAc), to recover the main antioxidant components that are soluble in oil. The yield of extraction was 12.6% on dry basis. The antiradical efficiency of the extract against DPPH was examined. The results revealed that EC50 value of 1000 g extract/kg DPPH. It also showed a recognizable antioxidant activity, by reducing the oxidation level in bulk corn oil enriched with 200, 500 and 1000 ppm of the 1-EAc extract at accelerated oxidation tests. The antioxidant activity increased with concentration up to 500 ppm, while no significant difference was observed between 500 and 1000 ppm, as in the previous experiments. The depression of PV was generally lower than that obtained by D, E and EAc extracts of successive extractions, while the depression of CD was comparably close to extracts of successive extractions. The oil enriched with the 1-EAc extract was applied in different food systems and variable conditions in order to extend the study of the antioxidant effect of the plant. As a primary approach, the oil with 200 ppm of the 1-EAc extract was used in making 20% oil-in-water emulsions, stabilized with Tween 20, that were used in two main series of experiments: in the first series the emulsions were subjected to oxidation in a shaking water bath at 40°C and 60°C for two weeks. The oxidation tests in both experiments were monitored by measurement of CD and thiobarbituric reactive substances (TBARs). It was found that as temperature increased from 40°C to 60°C, oxidation was increased, but in both cases the enrichment of emulsion with extract improved the emulsion stability. In the second series, the high hydrostatic pressure (HHP) treatment, used in the recent years as an alternative method in food processing, was employed. Bulk oil and oil-in-water emulsion were subjected to HHP treatments at 200 and 650 MPa so as to estimate the effect of the applied pressures on lipid oxidation during storage of the treated products and the antioxidant capacity of 1-EAc extract under these conditions. The HHP treated oil and emulsion samples were stored under accelerated oxidation conditions (70 °C), and oxidation was monitored through PV and CD measurements for the oil, and CD and TBARs measurement for the emulsion. According to the results, the effect of pressure is already evident at the initial point just after pressurization and before applying samples to further accelerated oxidation. The initial CD value of non HHP-treated emulsion samples was 0.129±0.01 g/100 g oil while it was increased to values 0.194±0.01 and 0.346±0.02 g/100 g oil after HHP treatment at 200 and 650 MPa, respectively. Similarly, the CD value of non HHP-treated oil samples was 0.57± 0.01 g/100g and amounted to 0.61± 0.02 g/100g and 0.66± 0.03 g/100g after HHP treatment at 200 and 650 MPa, respectively. Similar differences were also observed in the other oxidation indexes, i.e. TBARs and PVs, and can be attributed to the increase of the concentration of dissolved oxygen caused by the HHP treatment (from 0.014 mg/mL in non-treated emulsion to 0.029 mg/mL in 650 MPa-treated emulsion and from 0.024 mg/mL in non-treated oil to 0.029 mg/mL in 650 MPa-treated oil). HHP treated samples presented higher oxidation rates during storage, especially as pressure increased from 200 MPa to 650 MPa. Concerning the antioxidative effect of M. syriaca, the results showed that, the addition of 1-EAc extract at 200 ppm decreased the level of oxidation during storage of the samples subjected to HHP treatment (200 and 650 MPa) and atmospheric conditions by (i.e CD of emulsions decreased by 35.8% and 31.2.0% for 200 650 ppm respectively, CD of oil was decreased by 38.7% and 33.7% for 200 and 650 ppm respectively). Furthermore, antioxidant effectiveness of 1-EAc extract obtained from M. syriaca was evaluated in fried and baked food systems. More specifically, the extract was added at a concentration of 500 ppm to corn oil that was used for frying potato chips at 185 °C. The effect on the stability of frying the oil was examined (through measurements of polar content and CD during frying, while the effect on the fried product was estimated through measurements of CD and PV during storage of potato chips. The protection of the frying oil by M. syriaca extract was moderate, however, a remarkable improvement of the oxidative stability of the fried chips was observed through the decrease of peroxide value (PV) and CD from 41 to 28% and from 49 to 21%, respectively, compared to samples with no additive. As frying proceeded, the antioxidant protection of the extract against the oxidation of the fried product during storage was less effective although it was still powerful. The decrease of protective action might be attributed to loss of antioxidant activity due to the prolonged application of high temperature, as well as to the oxidation status of the oil that is higher as frying proceeds.Also, cookies were prepared by using corn oil enriched with 500 ppm of the extract. Samples of packaged and unpackaged cookies, were subjected to accelerated oxidation tests in oven at 70°C and oil stability was measured periodically.The PV of oil extracted from cookies cookies decreased by 25 % and the CD content by 20%. No difference in the protection between packaged unpackaged samples were observed, although unpackaged samples showed higher oxidation rates, as expected due to contact with air.The final approach was testing the antioxidant and antimicrobial potentiality of M. syriaca in Yellowfin tuna. The extract was added to refined corn oil at different concentrations (0–3900 ppm). Minced tuna was mixed with corn oil containing the extract (tuna ⁄ oil: 3 ⁄1 w⁄ w); the mixture was packed aerobically and stored at 0°C. The final concentration of the M. syriaca in tuna was varied in the range of 250 to 975 ppm. The antimicrobial activity was determined by measurement of total viable count, pseudomonas ssp. and lactic acid bacteria. The use of M. syriaca extract depressed the microbial growth with a concentration increasing-effect, and resulted in a maximum count of pseudomonas sp. of 5.5 log CFU/ g at 975 ppm, compared to 8.0 logCFU/ g for the non-enriched sample, showing good activity against pseudomonas sp. growth. The total viable count and lactic acid bacteria was also inhibited by M. syriaca extract, with concentrations of 750 and 975 ppm showing the best antimicrobial activity. The calculation of specific growth rate (k) indicated that all treatments containing M. syriaca extract, gave a significant reduction in microbial growth compared to the control samples (P E > EAc > P. Το EC50 ήταν 1030, 1500, 2739, and 6000 g εκχύλισματος/kg DPPH για D, E, EAc, και P, αντίστοιχα σε διαλύτη οξικό αιθυλεστέρα. Σε διαλύτη μεθανόλη, η δράση των εκχυλισμάτων αυξάνεται και επομένων το EC50 μειώνεται και ανήλθε σε 1000, 1018, 1423 για D, E, EAc, αντίστοιχα, ενώ το εκχύλισμα P δεν διαλύεται σε μεθανόλη. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν τα εκχυλίσματα ως προς τη δράση τους σε αραβοσιτέλαιο προσθέτοντας δείγματα στο λάδι με ανάδευση ώστε η συγκέντρωση να ανέλθει σε 200, 500 και 1000 ppm, ενώ οι διαλύτες απομακρύνθηκαν με διαβίβαση αζώτου. Τα δείγματα με τα εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε συνθήκες επιταχυνόμενης οξείδωσης (70 ºC) σε κλίβανο με κυκλοφορία αέρα. Η αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων εκτιμήθηκε με μέτρηση του αριθμού υπεροξειδίων (PV), και των συζυγών διενίων (CD) που αποτελούν πρωτογενή προϊόντα οξείδωσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα D και E εκχυλίσματα έχουν μεγαλύτερη προστασία, και ακολούθησαν τα EAc και P. Επίσης, η αύξηση της συγκέντρωσης από 200 σε 500 ppm, επιβραδύνει το σχηματισμό υπεροξειδίων, ενώ η αύξηση πάνω από 500 δεν έχει σημαντική επίδραση. Στο δεύτερο μέρος των πειραμάτων, συνεχίστηκε η εργασία με βάση την προηγούμενη πειραματική εμπειρία. Πραγματοποιήθηκε απλοποιημένη εκχύλιση του φυτού Μ. syriaca με ένα διαλύτη, τον οξικό αιθυλεστέρα (1- EAc). Η απόδοση σε ξηρή βάση ήταν 12.6 %. Ακολούθησε η μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης του εκχυλίσματος. Εξετάστηκε η δέσμευση ελευθέρων ριζών του 1- EAc σε DPPH/ μεθανόλη και το ΕC50 ήταν 1000 g εκχύλισμα/kg DPPH. Στη συνέχεια, το εκχύλισμα 1- EAc εξετάστηκε ως προς τη δράση του σε αραβοσιτέλαιο, σε συγκεντρώσεις 200, 500 και 1000 ppm, στις συνθήκες επιταχυνόμενης οξείδωσης (70 °C). Η οξείδωση εκτιμήθηκε με μέτρηση των PV και CD.Γενικά, η επιβράδυνση του PV από 1- EAc, βρέθηκε μικρότερη από τα εκχυλίσματα D, E και παρόμοια με τη δράση του εκχυλίσματος EAc από διαδοχικές εκχυλίσεις, ενώ η επιβράδυνση του CD ήταν παρόμοια με εκείνη από τα εκχυλίσματα από διαδοχικές εκχυλίσεις.Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το εκχύλισμα 1- EAc σε συστήματα λιπαρών τροφίμων, για να μελετηθεί η αντιοξειδωτική δράση σε διάφορες συνθήκες, αλλά και η αντιμικροβιακή του δράση. Αρχικά, το εκχύλισμα (200 ppm) χρησιμοποιήθηκε σε γαλάκτωμα 20 % λάδι σε νερό χρησιμοποιώντας Tween-20 ως γαλακτωματωποιητή, και τα δείγματα αφέθηκαν για οξείδωση σε υδατόλουτρο στους 40 °C και 60 °C. Η σταθερότητα των δειγμάτων εκτιμήθηκε μέσω του προσδιορισμού των CD, ως πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης και των ενώσεων που αντιδρούν με θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARs), που αποτελούν δευτερογενή προϊόντα οξείδωσης και συγκεκριμένα μηλονική αλδεΰδη που προέρχεται από τη διάσπαση πρωτογενών προϊόντων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αύξηση θερμοκρασίας προκαλεί αύξηση της οξείδωσης, ενώ η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος διατηρείται και στις υψηλότερες θερμοκρασίες.Στην επόμενη σειρά πειραμάτων, δοκιμάστηκαν δείγματα αραβοσιτελαίου και γαλακτώματος 20 % αραβοσιτελαίου σε νερό με, και χωρίς προσθήκη εκχυλίσματος 1-ΕΑc από M. syriaca σε συγκέντρωση 200 ppm σε κατεργασία υπερυψηλής πίεσης (ΥΥΠ), η οποία αποτελεί μία καινοτόμο διεργασία συντήρησης των τροφίμων. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε κυλινδρικό θάλαμο υπερυψηλής πίεσης και συμπιέστηκαν σε πιέσεις 200, και 650 MPa. Στη συνέχεια, όλα τα δείγματα, επεξεργασμένα και μη με ΥΥΠ, αποθηκεύτηκαν σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 70 °C, και μελετήθηκε η οξείδωση αυτών. Η οξείδωση εξετάστηκε με την μέτρηση CD και PV στο λάδι, και CD και TBARs σε γαλακτώματα, σε περίοδο δύο εβδομάδων. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων οξείδωσης έδειξαν ότι τα έλαια και γαλακτώματα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΥΥΠ παρουσίασαν ταχύτερο ρυθμό οξείδωσης, ο οποίος αυξανόταν με την αύξηση της πίεσης από 200 σε 650 MPa. Αυτό οφείλεται στην αύξηση του διαλυμένου οξυγόνου με αύξηση της πίεσης. Συγκεκριμένα προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα των δειγμάτων γαλακτώματος και ελαίου και βρέθηκε ότι η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνο αυξήθηκε από 0.014 mg/mL στα γαλακτώματα πριν την διεργασία ΥΥΠ, στο 0.029 mg/mL για γαλακτώματα που υποβλήθηκαν σε πίεση 650 MPa, και από 0.024 mg/mL στο λάδι πριν την διεργασία ΥΥΠ στα 0.029 mg/mL σε λάδι που υποβλήθηκε σε πίεση 650 MPa.Σχετικά με την αντιοξειδωτική δράση του M. syriaca, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, ο εμπλουτισμός με 1-EAc στη συγκέντρωση 200 ppm προστάτεψε τα δείγματα που συμπιέστηκαν με ΥΥΠ σε 200 και 650 MPa έναντι της οξείδωσης των λιπαρών κατά την αποθήκευση σε συνθήκες επιταχυνόμενης οξείδωσης, μειώνοντας τα προϊόντα οξείδωσης κατά 35.8 % και 31.2 % στα γαλακτώματα για 200 και 650 MPa, αντίστοιχα, και στα 38.7 % και 33.7 % στο λάδι, για 200 και 650 MPa αντίστοιχα. Το εκχύλισμα 1-EAc εξετάστηκε επίσης σε τρόφιμα που υφίστανται κατεργασία σε υψηλές θερμοκρασίες, όπως τηγάνισμα και ψήσιμο. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε αραβοσιτέλαιο εμπλουτισμένο με το εκχύλισμα (500 ppm) σε τηγάνισμα τσιπς στους 185 °C, ενώ παρασκευάσθηκαν μπισκότα τύπου cookies με αραβοσιτέλαιο εμπλουτισμένο εμπλουτισμένο με το εκχύλισμα (500 ppm) τα οποία ψήθηκαν στους 160 °C. Η δράση του εκχυλίσματος στο τηγάνισμα, εξετάσθηκε τόσο στη σταθερότητα του ελαίου τηγανίσματος όσο και στη σταθερότητα των προϊόντων κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Η σταθερότητα του ελαίου κατά την διάρκεια του τηγανίσματος εξετάστηκε με τη μέτρηση των ολικών πολικών συστατικών, που αποτελούν τον πλέον αποδεκτό δείκτη για τα έλαια τηγανίσματος όσο και με τη μέτρηση των CD, που παρουσιάζουν καλή συσχέτιση με τα πολικά συστατικά. Η αντιοξειδωτική δράση κατά την αποθήκευση των τσιπς εξετάστηκε με μέτρηση των CD και PV σε δείγματα που απομακρύνθηκαν από το τηγάνι μετά από 0 έως 16 h τηγανίσματος. Το εκχύλισμα του M. syriaca έδειξε μέτρια προστασία στο έλαιο τηγανίσματος, αλλά καλή δράση στα τσιπς, όπου μείωσε τα PVκαι CD από 41 έως 28 % και 49 έως 21 %, αντίστοιχα, με σύγκριση με τα δείγματα χωρίς εκχύλισμα. Η αντιοξειδωτική δράση κατά την αποθήκευση μειώθηκε στα δείγματα που είχαν απομακρυνθεί από το τηγάνι μετά από μεγαλύτερο διάστημα επαναλαμβανόμενων τηγανισμάτων, άλλα ήταν ακόμη σημαντική. Η μείωση της προστασίας μπορεί να οφείλεται σε απώλεια του αντιοξειδωτικού κατά την παρατεταμένη θέρμανση, αλλά και στη χειρότερη οξειδωτική κατάσταση του ελαίου που έχει αποροφηθεί στα τσιπς. Τα μπισκότα τύπου cookies, στα οποία προστέθηκε το εκχύλισμα, μετά το ψήσιμο χωριστήκαν σε δύο παρτίδες, με συσκευασία και χωρίς, και υποβλήθηκαν σε συνθήκες επιταχυνόμενης οξείδωσης (70 ºC) σε κλίβανο με κυκλοφορία αέρα. Παράλληλα παρασκευάσθηκαν δείγματα αναφοράς και αποθηκεύτηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι προσθήκη του εκχυλίσματος M. Syriaca στα μπισκότα οδήγησε σε μικρότερους ρυθμούς οξείδωσης όπως προέκυψε από τις τιμές CD και PV που μετρηθήκαν στο λάδι που εκχυλίστηκε από τα μπισκότα κατά την διάρκεια της αποθήκευσης. Το PV μειώθηκε κατά 25 % και το CD κατά 20 %. Η προστασία του εκχυλίσματος ήταν ίδια στα συσκευασμένα και μη συσκευασμένα δείγματα, ενώ η οξείδωση στα μη συσκευασμένα δείγματα ήταν ταχύτερη από τα συσκευασμένα αφού είχαν άμεση επαφή με τον αέρα. Τέλος, μελετήθηκε η αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή δράση εκχυλίσματος Μ. syriaca σε τόνο (Yellowfin tuna). Τα δείγματα που παρασκευάστηκαν ήταν πολτοποιημένος τόνος αναμεμειγμένος με αραβοσιτέλαιο σε αναλογία ψαριού/λαδιού 3:1. Χρησιμοποιήθηκε μη εμπλουτισμένο αραβοσιτέλαιο για τα δείγματα αναφοράς και αραβοσιτέλαιο που περιείχε εκχύλισμα M. Syriaca, ώστε η τελική συγκέντρωση στο μίγμα να είναι 250, 500, 750, και 975 ppm, στα δείγματα ελέγχου. Τα δείγματα συντηρήθηκαν στους 0 ºC. Η αντιμικροβιακή δράση μετρήθηκε με προσδιορισμό της ολικής μικροβιακής χλωρίδας, των ψευδομονάδων, και των γαλακτικών βακτηρίων, και η αντιοξειδωτική δράση βάσει του προσδιορισμού των PV και ΤΒΑRs του λιπαρού που εκχυλίστηκε από τα δείγματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν προστασία έναντι της οξείδωσης για τα δείγματα του τόνου που εμπλουτίστηκαν με το εκχύλισμα, η οποία αυξανόταν με αύξηση της συγκέντρωσης.Η χρήση του M. syriaca μείωσε επίσης τη μικροβιακή ανάπτυξη, με δράση αυξανόμενη με τη συγκέντρωση. Μεγαλύτερη ανάπτυξη στα δείγματα παρουσίασαν οι ψευδομονάδες, των οποίων η συγκέντρωση αυξήθηκε από 3.34-3.95 log CFU/g σε 8.0 log CFU/ g, εντός 10 ημερών, στα μη εμπλουτισμένα δείγματα. Η προσθήκη εκχυλίσματος 975 ppm μείωσε τη συγκέντρωση των ψευδομονάδων σε 5.5 log CFU/ g, δείχνοντας καλή αντιμικροβιακή δράση. Η ολική μικροβιακή χλωρίδα και τα γαλακτικά βακτήρια μειώθηκαν επίσης, και οι συγκεντρώσεις 750 και 975 ppm είχαν την καλύτερη αντιμικροβιακή δράση, χωρίς σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Ο υπολογισμός της σταθεράς του ρυθμού της μικροβιακής ανάπτυξης (k) έδειξε ότι τα εμπλουτισμένα με εκχύλισμα δείγματα παρουσίασαν σημαντικά μικρότερες τιμές, οι οποίες γενικά μειώνονταν με αύξηση της συγκέντρωσης. H μείωση ήταν 58 %, 43 % και 69 % πάνω από συγκεντρώσεις 500, 750 και 975 ppm για τη σταθερά του ρυθμού ανάπτυξης των ψευδομονάδων, της ολικής μικροβιακής χλωρίδας και των γαλακτικών βακτηρ