Targeted and untargeted lipid analysis of platelets by liquid chromatography coupled to mass spectrometry

Lipids play various roles in cells, e.g. membrane building, energy storage and signalling. A distinctive class of lipids, important for bioactive signalling, consists of oxylipins. Oxylipins are formed by oxidation of polyunsaturated fatty acids which in turn might have been released from more complex lipids by the enzymatic activity of phospholipases. Lipids including oxylipins play a major role in platelet activation. Analysis of a changing platelet lipidome during their activation allows researchers to learn about biochemical pathways associated with this process and to select new therapeutic targets for novel drugs against diseases, in which platelets are involved. The last decades have brought unprecedented technological innovations in analytical chemistry including separation science (e.g. highly efficient sub-2 µm particles for stationary phases, capillary columns for liquid chromatography (LC) and novel chiral materials) and mass spectrometry (MS) (e.g. high resolution instrument, increased sensitivity, novel analytical strategies like untargeted profiling with sequential window acquisition of all theoretical fragment ion mass spectra (SWATH)). The inventions have enabled the exponential growth in various ‘omics’ branches, also lipidomics. In my first project, a combined targeted-untargeted LC-MS/MS method was developed for the analysis of oxylipins and fatty acids in platelet releasates. The MS data was acquired with the SWATH approach and the acquisition windows were optimized to ensure wide coverage of analytes and to provide high sensitivity and low limits of detection for the 3 targeted compounds: thromboxane B2 (TXB2), 12-hydroxy-5Z,8E,10E-heptadecatrienoic acid (HHT) and 12-keto-5Z,8E,10E-heptadecatrienoic acid (KHT). In this context, a general synthesis method for keto-analogues of hydroxy fatty acids in presence of double bonds was proposed for the preparation of standards. The sample analysis revealed that activated platelets release high amounts of TXB2, HHT and KHT: in average 13, 15 and 0.6 attomoles per platelet, respectively. Furthermore, untargeted analysis showed a significantly increased release in other oxylipins upon the activation, but also in polyunsaturated fatty acids (PUFA). There is less awareness of the release of a broad range of biologically active oxylipins and PUFA during platelet activation and the biological implications are not fully understood at the moment. My second study involved the development of a new LC method for oxylipin separation with a capillary column (inner diameter equal to 0.5 mm). Scheduled selected reaction monitoring (SRM) for MS/MS detection provided high sensitivity, accuracy and precision for quantification of 42 oxylipins. Thirteen internal standards were spread across the LC separation and used for normalization of analyte signals. Moreover, various extraction protocols and calibration methods were compared. The Bond Elut Certify II cartridges (mixed-mode reversed-phase/anion-exchange material) for solid phase extraction and external matrix-matched calibrants were used in the final method. The method was validated with concentrated plasma, which was an easily available, but challenging biological matrix. The final analysis detected 19 oxylipins in resting platelets. The third analytical method, which was developed in this work, utilized a modern chiral LC column for enantiomeric separation of oxylipins. The method showed an outstanding peak resolution and great sensitivity provided by SRM MS/MS detection. Nineteen enantiomeric pairs and one diastereomeric pair of hydroxy fatty acids were quantified in on air autoxidized PUFA and in platelet releasates. The autoxidized samples contained, as expected, racemic mixtures, but the single enantiomers were mostly detected in platelet samples with 12(S)-hydroxyeicosatetraenoic (12(S)-HETE) being the highest abundant oxylipin in the thrombin activated samples. An interesting observation was made about 12-hydroxyeicosatrienoic acid (12-HETrE), which seems to be synthetized in platelets via 2 different enzymatic reactions. Parallel to the more specific methods, described above, sets of platelets were analysed with a reversed-phase LC-MS/MS method for the general lipid analysis. The sets included platelets treated in-vitro with a selective CXCR7 receptor agonist, untreated control, thrombin-activated platelets as well as CXCR7 agonist/thrombin activated platelets, and the untargeted SWATH data acquisition was utilized for lipid profiling. What is more, a novel approach for post-acquisition data processing by targeted feature extraction on MS1 and MS2 level including improved peak picking, lipid identification and quantification was developed and it provided higher assay specificity then conventional methods. The lipid identification was supported by the characteristic elution pattern in reversed-phase LC and quantification was done mostly using extracted ion chromatograms (EIC) of fragments from SWATH. The final results of platelet lipidomes showed that changes typical for platelet activation (e.g. increase in the concentration of oxylipins and lysophosphatidylinositols) were highly supressed in the samples, where the CXCR7 agonist was added. That means that the agonist is capable of reducing platelet activation. On the other hand, the agonist itself also influenced the platelet lipidome, as it showed increased level of acylcarnitines and decrease in diglycerides, when compared to resting platelets.Lipide haben unterschiedliche Funktionen in biologischen Zellen, z.B. Membranaufbau, Energiespeicherung und Signalübertragung. Eine charakteristische Klasse von Lipiden, die für die bioaktive Signalübertragung wichtig ist, besteht aus Oxylipinen. Oxylipine werden durch Oxidation von Fettsäuren gebildet, die ihrerseits durch die enzymatische Aktivität von Phospholipasen aus komplexen Lipiden freigesetzt werden können. Lipide, einschließlich der Oxylipine, spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten. Forscher interessieren sich nun für das Lipidom in Thrombozyten und für dessen Änderung während ihrer Aktivierung und wollen so die an diesem Prozess beteiligten biochemischen Wege kennenlernen, um schließlich neue therapeutische Ansätze gegen Krankheiten zu finden, an denen Thrombozyten beteiligt sind. Die letzten Jahrzehnte haben beispiellose technologische Innovationen in der analytischen Chemie gebracht, wie in der Chromatographie (z.B. hocheffiziente sub-2-µm-Partikel für stationäre Phasen, Kapillarsäulen für die Flüssigkeitschromatographie (LC), neuartige chirale Materialien) oder in der Massenspektrometrie (MS) (z.B. Massenspektrometer mit erhöhter Auflösung oder erhöhter Empfindlichkeit, neuartige Analysestrategien wie nicht-zielgerichtetes Profiling mittels so genannter “sequential window acquisition of all theoretical fragment ion mass spectra” (SWATH)-Datenerfassung). Diese Neuerungen haben das exponentielle Wachstum in den verschiedenen „Omics“ -Wissenschaften, wie auch in der Lipidomik vorangetrieben. In meinem ersten Projekt wurde eine kombinierte zielgerichtete LC-MS/MS-Methode zur Analyse von Oxylipinen und Fettsäuren entwickelt, und in Zellüberständen von Thrombozyten angewendet. Die MS-Daten wurden mit der SWATH- Datenerfassung erfasst und die Methode dahingehend optimiert, eine breite Abdeckung der Analyten sicherzustellen und die erforderliche Empfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenzen für die 3 Zielverbindungen, Thromboxan B2 (TXB2), 12-Hydroxy-5Z,8E,10E-Heptadecatriensäure (HHT) und 12-Keto-5Z,8E,10E-Heptadecatriensäure (KHT), zu gewährleisten. Darüber hinaus wurde eine neue allgemeine Synthesemethode für Ketoanaloga von Hydroxyfettsäuren beschrieben. Die Studie ergab schließlich, dass aktivierte Blutplättchen hohe Mengen an TXB2, HHT und KHT freisetzen: durchschnittlich 13, 15 bzw. 0,6 attomol pro Blutplättchen. Darüber hinaus zeigte eine nicht-zielgerichtete Analyse einen signifikanten Anstieg anderer Oxylipine und mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA), die bei der Aktivierung freigesetzt werden. Über dieses Phänomen ist bisher wenig bekannt und seine biologische Bedeutung ist noch nicht vollständig geklärt. Meine zweite Studie befasste sich mit der Entwicklung einer neuen LC-Methode zur Oxylipin-Trennung mit einer Kapillarsäule (Innendurchmesser gleich 0,5 mm). Ein so genanntes „scheduled selected reaction monitoring“ (SRM-MS/MS) lieferte hohe Empfindlichkeit, Genauigkeit und Präzision für die Quantifizierung von 42 Oxylipinen. 13 interne Standards wurden über die LC-Trennung verteilt und zur Normalisierung der Analyten verwendet. Darüber hinaus wurden verschiedene Extraktionsprotokolle und Kalibrierungsmethoden verglichen. Die optimierte Methode verwendet Bond Elut Certify II-Kartuschen (mit Mixed-Mode reversed-phase/Anionenaustauscher Material) zur Festphasenextraktion und externe matrix-matched Kalibranten. Die Methode wurde mit konzentriertem Plasma validiert, das eine leicht verfügbare, wenngleich herausfordernde biologische Matrix war. Es konnten somit 19 Oxylipine in nicht-aktivierten Blutplättchen nachgewiesen werden. Die dritte, von mir entwickelte Analysemethode verwendete eine moderne chirale LC-Säule zur Enantiomerentrennung von Oxylipinen. Das Verfahren zeigte eine hervorragende Peakauflösung und eine hohe Empfindlichkeit, die durch die SRM-MS/MS-Detektion bereitgestellt wurden. Neunzehn Enantiomerenpaare und ein Diastereomerenpaar von Hydroxyfettsäuren wurden in an der Luft autoxidierten PUFA und in Zellüberständen von Thrombozyten quantifiziert. Die autoxidierten Proben enthielten erwartungsgemäß racemische Gemische, wohingegen die einzelnen Enantiomere meist in den Thrombozytenproben nachgewiesen wurden. Dabei war die 12(S)-Hydroxyeicosatetraensäure (12(S)-HETE) das höchst abundante Oxylipin in den Thrombin-aktivierten Proben. Weitere interessante Beobachtungen wurden über die 12-Hydroxyeicosatriensäure (12-HETrE) gemacht, die offenbar über 2 verschiedene enzymatische Reaktionen in Blutplättchen synthetisiert werden kann. Parallel zu den oben beschriebenen, gezielten Methoden wurden Thrombozytengruppen mit einer Umkehrphasen-LC-MS/MS-Methode für die allgemeine nicht-zielgerichtete Lipidanalyse analysiert. Die Sets enthielten Thrombozyten, die in vitro mit einem selektiven CXCR7-Rezeptoragonisten behandelt wurden, neben Kontrollen ohne diesem Agonist, Gruppen mit Plättchen die durch Thrombin aktiviert wurden sowie mit Thrombin und CXCR7 Agonist, und die nicht-zielgerichtete SWATH-Datenerfassung wurde für das Lipid Profiling verwendet. Darüber hinaus wurde ein neuartiger Ansatz für die Datenverarbeitung nach der SWATH Datenerfassung entwickelt, der ein verbessertes Peak-Picking, eine Lipididentifikation und Lipidquantifizierung umfasst und eine höhere Spezifität als herkömmliche Methoden bietet. Die Lipididentifikation wurde durch ein charakteristisches Elutionsmuster in Umkehrphasen-LC unterstützt, und die Quantifizierung erfolgte hauptsächlich unter Verwendung extrahierter Ionenchromatogramme (EIC) von Fragmenten aus SWATH. Die Endergebnisse der Thrombozytenlipidomen zeigten, dass Änderungen, die für die Thrombozytenaktivierung typisch sind (z.B. Erhöhung der Konzentration von Oxylipin und Lysophosphatidylinositol), nach Zugabe des CXCR7-Agonisten, stark unterdrückt waren. Dies bedeutet, dass der Agonist die Thrombozytenaktivierung reduzieren kann. Andererseits beeinflusste der Agonist selbst auch das Thrombozytenlipidom, da er im Vergleich zu ruhenden Thrombozyten einen erhöhten Acylcarnitinspiegel und eine Abnahme der Diglyceride aufwies