Role of impaired lysosomal trafficking in the development of lung fibrosis in a murine model of Hermansky-Pudlak syndrome

Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) comprises of a group of rare hereditary disorders primarily affecting transport within lysosome related organelles. Up to now, 16 (mice) and 8 (human) genes, respectively, have been found to cause this disease. Amongst other clinical symptoms, patients with HPS may develop lung fibrosis (HPS associated Interstitial Pneumonia; HPSIP). As a consequence of such organ involvement, quality of life is then greatly reduced and prognosis is poor. The underlying molecular reasons for the development of HPSIP had yet not been settled. However, on an ultrastructural level, patients with HPSIP impose with an abnormal enlargement and increased number of lamellar bodies, a lysosome related organelle of alveolar type II cells (AECII) that represents the intracellular storage and secretion form of pulmonary surfactant. Drawn against this background, the genotype-phenotype correlation was analyzed in mice with different single and combined HPS mutations. This work primarily focussed on the extent of pulmonary fibrosis and performed an in depth surfactant analysis in the lungs of HPS1, HPS2, HPS6, HPS1/6, HPS1/2 and respective wild type mice. In addition, altered signalling pathways and cellular consequences were studied. Histological studies, undertaken after 3 and 9 months of age, revealed that only HPS1/2 mice, but none of the other HPS mice, would develop lung fibrosis, being quite extensive by 9 months of age. In these mice, but in none of the other mice, AECII appeared swollen and seemed to contain more and larger lamellar bodies. On the other hand, especially the HPS1/6 mice revealed spontaneous development of airspace enlargement. Defective intracellular surfactant trafficking and secretion was a prominent finding in HPS 1/2 mice and caused a highly significant intracellular accumulation of the mature hydrophobic surfactant proteins SP-B and SP-C as well as phospholipids. Among the phospholipids, especially the dipalmitoylated phosphatidylcholine (DPPC), the most abundant surfactant compound, was significantly elevated in lung tissues of HPS 1/2 mice. Isolated AECII from these mice revealed similar results. In contrast, although these above mentioned surfactant compounds appeared slightly increased in the mono mutant and the HPS 1/6 mice, there was a significant difference between HPS1/2 on the one, and the other mice on the other hand with regard to the extent of disturbed intracellular transport and accumulation of surfactant compounds. As a possible consequence of such defective transport and secretion of surfactant, AECII apoptosis was observed extensively in 3 and 9 month old HPS1/2 mice by in-situ apoptosis assay and by immunohistochemistry of cleaved caspase 3. Hypothesizing that apoptosis of AECII in HPS1/2 mice would develop due to severe cellular stress, lysosomal and ER stress markers in these mice were investigated. The lysosomal protease, cathepsin D, was highly elevated in lung homogenates and isolated AECII of HPS1/2 mice, but, again, in none of the other mutant mice. Such increase in cathepsin D was already visible at the age of 3months. These results indicate an early onset lysosomal stress specifically in HPS1/2 mice. Apart from this, HPS 1/2 mice also exhibited signs of severe ER stress at a later age (9 months). In detail, CHOP, a proapoptotic factor specifically induced by unresolved ER-stress, was found to be highly and exclusively elevated HPS1/2 mice. In addition, lipidomic profiling of 9 month old lung tissues from all HPS mice revealed increased levels of glucosylceramides only in HPS1/2 mice, which also hints towards a serious cellular stress in these mice. Data from the HPS1/2 mouse model was aptly supported by those obtained from HSPIP patients. As compared to lung transplant donor lungs, paraffin sections of lungs from two HPSIP patients (HPS1 mutation) showed a highly increased immunostaining for cathepsin D in AECII, alongside with induction of caspase-3 and CHOP immunostaining in this cell-type, thereby confirming the cellular stress mechanisms as observed in HPS1/2 mice. Taken together, this is the the first time to decipher HPS1/2 mice as a valuable animal model of human HPSIP. With regard to the clinical similarities and common pathomechanistic principles between HPSIP and patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), HPS 1/2 mice also offer as the currently best available model of IPF. This study showed that defective intracellular surfactant trafficking in AECII of these mice leads to the development of lysosomal and ER stress, finally resulting in AECII apoptosis, and – at the end - development of lung fibrosis. Analysis of markers of lysosomal and ER-stress in human HPSIP samples fully corroborated such pathomechanistic concept and lends further credit to the general concept that apoptosis of the AECII represents a key step in the development of lung fibrosis in non-inflammatory triggered forms of Interstitial Lung Diseases. On the basis of these results, further elucidation of the molecular mode of action and the binding partners of the concerned HPS gene products (adaptor protein 3 and BLOC 3) appears reasonable and therapeutic strategies aiming to either restore the defective transport mechanism or to block the cellular stress response or AECII apoptosis are warranted.Das Hermansky-Pudlak syndrom (HPS) umfasst eine Reihe seltener und vererbbarer Erkrankungen, die primär alle zu einer Beeinträchtigung lysosomaler Transportprozesse führen und klinisch ein vergleichbares Spektrum an Beschwerden und Symptomen auslösen. Bis dato sind 16 (Maus) bzw. (Mensch) verschiedene Gene bekannt, die im Falle einer Mutation die Erkrankung auslösen können. Neben vielfältigen anderen krankheitsdefinierenden Symptomen entwickeln viele betroffene Patienten eine Lungenfibrose (HPS associated Interstitial Pneumonia; HPSIP). In diesem Fall entwickelt sich eine deutliche Einschränkung der Lebensqualität und die Prognose der betroffenen Patienten ist schlecht. Die der Entwicklung der HPSIP zugrunde liegenden Pathomechanismen waren bis dato nicht bekannt, allerdings wurde in früheren post-mortem Analysen ein auffälliges Erscheinungsbild der alveolären Typ II Zellen (AECII) beschrieben, mit einer vermehrten Anzahl und einer Vergrößerung der Lamellarkörperchen, dem lysosomalen Organell der AECII, in dem pulmonaler Surfactant intrazellulär gespeichert wird. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, eine Korrelation des Genotyps mit dem Phänotyp bei verschiedenen mono- oder doppelt mutanten HPS Mäusen (HPS 1, 2, 6, 1/2, 1/6) im Vergleich zum genetischen Hintergrund durchzuführen. Im Fokus stand hierbei zunächst die Frage ob auch bei murinen HPS Formen eine HPSIP auftritt und welche assoziierten Veränderungen des Surfactantsystems hierbei beobachtet werden können. Weiterhin wurden verschiedene zelluläre Stresspfade, wie lysosomaler Stress oder Endoplasmatisches Retikulum (ER)-Stress, untersucht und mit den anderen Befunden korreliert. Die im Alter von 3 und 9 Monaten durchgeführten histologische Untersuchung ergaben, dass ausschließlich die HPS 1/2 Mäuse eine Lungenfibrose entwickelten, die mit 3 Monaten noch sehr diskret, mit 9 Monaten aber voll ausgeprägt war. In diesen HPS 1/2 Mäusen, nicht aber in den anderen HPS Mäusen und Wildtyp Tieren, konnte auch ein den Patienten mit HPSIP entsprechendes Erscheinungsbild der AECII beobachtet werden, mit einer deutlichen Schwellung und einer Zunahme des Gehalts an Lamellarkörperchen. Die im Anschluß durchgeführte Analyse des pulmonalen Surfactantsystems ergab sowohl im Lungengewebe als auch in isolierten AECII der HPS 1/2 Mäuse eine hochsignifikante Störung des intrazellulären Transports von Surfactantkomponenten, die zu einer intrazellulären Akkumulation der maturen hydrophoben Surfactant Proteine SP-B und SP-C sowie der Phospholipide führte. Bzgl. der Phospholipide konnte vor allem eine hochsignifikante Akkumulation des dipalmitoylierten Phosphatidylcholins (DPPC) in den Lungen der HPS 1/2 Mäuse beobachtet werden. Obwohl auch in den anderen HPS Mäusen eine moderate Störung der intrazellulären Surfactanthomöostase beobachtet werden konnte, war der Unterschied dieser Veränderungen zwischen den HPS 1/2 und den anderen HPS und den Wildtyp Tieren doch erheblich und ebenfalls hochsignifikant. Als mögliche Folge dieses hochgradig gestörten intrazellulären Surfactanttransports konnte ausschließlich in den HPS 1/2 Mäusen, und zwar bereits im Alter von 3 Monaten, eine Apoptose der AECII mittels der TUNEL Methode oder der Immunohistochemie (IHC) für gespaltene Kaspase 3 beobachtet werden. In den anderen HPS oder Wildtyp Tieren war dies in keinem Fall zu beobachten. Als zugrunde liegende zelluläre Stressreaktionen konnte zunächst eine Induktion des Kathepsin D in den AECII der HPS 1/2, nicht aber in den anderen HPS Mäusen, mittels Western Blot und ICH nachgewiesen werden. Dieser lysosomale Stressmarker war bereits im Alter von 3 Monaten erhöht. Noch nicht in diesem Alter, aber dann mit 9 Monaten ebenfalls prominent nachweisbar, war CHOP, ein proapoptotisch wirksamer Faktor, der infolge eines anhaltenden und nicht korrigierbaren ER-Stresses entsteht und zwingend mit der Entwicklung der Apoptose einhergeht Auch dieses Faktor wurde exklusiv in den AECII von HPS 1/2 Mäusen beobachtet. Schließlich fiel im Rahmen von Untersuchungen des Lipidoms auch noch eine Erhöhung des relativen Anteils von Glukosylceramiden auf, ebenfalls ein Marker für eine schwerwiegende Stressantwort der Zelle. Die in den HPS 1/2 Mäusen gewonnenen Daten konnten im Lungengewebe von zwei Patienten mit HPSIP vollständig reproduziert werden: auch hier fand sich im Vergleich zum Lungengewebe von Organdonoren eine deutliche Induktion von Kathepsin D und CHOP in den AECII, die zudem auch größtenteils Zeichen der stattfindenden Apoptose aufwiesen. Zusammengefasst konnte mit den HPS 1/2 Mäuse werden ein murines Korrelat der am Patienten zu beobachtenden HPSIP beschreiben. Aufgrund der Ähnlichkeiten hinsichtlich des klinischen Beschwerdebildes und der Prognose dieser Patienten mit Patienten mit einer Idiopathischen Pulmonalen Fibrose (IPF), stellen HPS 1/2 Mäuse unserer Meinung nach außerdem das derzeit beste Modell der IPF dar. In diesen HPS 1/2 Mäusen bewirkt der gestörte intrazelluläre Transport und Sekretion von Surfactantkomponenten einen frühen lysosomalen Stress, gefolgt von einer späteren ER-Stress, die beide die Apoptose der AECII und – über noch zu definierende Schritte – die Lungenfibrose auslösen. Die Analyse von Markern eines lysosomalen und eines ER-Stresses in Patienten mit HPSIP bestätigen in vollem Umfang dieses pathomechanistische Konzept und stärken die Annahme, dass die unkontrollierte Apoptose der AECII ein Schlüsselvorgang bei der Entwicklung nicht-inflammatorisch getriggerter Formen der Lungenfibrose darstellt. Unsere Untersuchungen befürworten die weitere Aufdeckung der molekularen Wirkungsweise und intrazellulärer Bindungspartner der HPS 1/2 Genprodukte (Adaptor Protein 3, BLOC3) in den AECII. Darüberhinaus erscheint die therapeutische Korrektur des gestörten Surfactant- Transports wie auch die mögliche Blockade der lysosomalen- oder ER-Stress Antwort in den AECII als hoffnungsvoller therapeutischer Ansatz der Behandlung der HPSIP