AMPA receptor trafficking and regulation by prominent auxiliary subunits in cultured hippocampal neurons

α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate type receptors (AMPARs) are ligand-gated cation channels that reside at glutamatergic synapses throughout the vertebrate central nervous system and play a prominent role in excitatory synaptic transmission. Regulated plasma membrane delivery and reuptake of AMPARs are critical for synaptic receptor accumulation, synaptic homeostasis, and neurotoxicity. While AMPARs are thought to continuously cycle between plasma membrane and intracellular compartments via exocytosis and endocytosis (Ehlers*, 2000; Yudowski et al., 2007), many organizational and regulatory aspects of AMPAR turnover are still unclear to this date. Here, we have analyzed AMPAR dynamics in dendritic and somatic areas of cultured hippocampal neurons in live cell imaging, taking advantage of genetically encoded tags for the visualization of receptors. To study the membrane delivery of AMPAR from transport organelles, GRIA1 subunits were N-terminally fused with the pH-dependent GFP derivative superecliptic pHluorin, which is quenched in the acidic lumen of transport organelles but regains its full fluorescence in a neutral environment during exocytosis. In a basic characterization of our model system, we show that AMPARs are predominantly (>80% of all events) inserted from recycling endosomes into adjacent plasma membrane areas. Interestingly, AMPAR delivery was associated with fluorescence transients that exhibit considerable variation, ranging from fast flickers to long-lasting events, in accord with previous work (Jullie et al., 2014; Yudowski et al., 2007). These varying signal types likely represent mechanistically different fusion events, with the fluorescence decay frequently reporting reacidification of recycling endosomes after transient membrane merger rather than an actual receptor dispersion on the plasma membrane. To analyze receptor uptake, we employed genetically-encoded self-labelling tags that allow for pulse-chase assays. Using an N-terminal HaloTag-GRIA1 fusion protein, we established an acute staining procedure to label the surface pool of AMPAR in neurons. For this purpose, HaloTag-GRIA1-expressing neurons were incubated with membrane-impermeable fluorescently-labelled ligands for short intervals, resulting in covalent attachment of the fluorophores to the HaloTag domain due to its enzymatic activity. By using fluorescently-labeled synaptic markers, we could specifically follow the progressive uptake of labelled HaloTag-GRIA1 at synaptic as well as extrasynaptic sites. It has become evident during recent years that native AMPARs are generally associated with auxiliary subunits, which modulate channel function and facilitate forward trafficking from the ER towards the plasma membrane. Two prominent auxiliary subunits, TARPɣ8 and CKAMP44a, have been shown to govern AMPAR function in hippocampal neurons (Khodosevich et al., 2014; Rouach et al., 2005). While auxiliary subunits putatively contribute to the synaptic anchorage of AMPARs via C-terminal interactions with scaffolding proteins, little is known about the influence of these auxiliary subunits on the local dendritic turnover of AMPARs. Here, we have investigated how changes in the abundance of TARPɣ8 or CKAMP44a affect the trafficking of AMPAR under basal conditions. For this purpose, we overexpressed each type of auxiliary subunit and investigated AMPAR behavior in live cell imaging experiments. Strikingly, we found that overexpression of TARPɣ8 or CKAMP44a did not significantly change surface expression of AMPAR but exerted profound effects on receptor cycling: First, the fusion rate of AMPAR-containing transport organelles with the plasma membrane appeared dramatically reduced when assayed by pHluorin-GRIA1 after overexpression of TARPɣ8 or CKAMP44a. This change was accompanied by a reduced pool of AMPAR in recycling endosomes, pointing to an overall reduced recycling of AMPARs. Second, the endocytic reuptake of receptors was significantly reduced in cells overexpressing either auxiliary subunit, as indicated by a decelerated constitutive incorporation of labelled HaloTag-GRIA1-containing receptors under basal conditions. This effect was specific for the extrasynaptic receptor pool, excluding the possibility that enhanced synaptic anchorage of receptors led to an apparent stabilization of the surface receptor pool. A similarly reduced receptor uptake in the presence of the auxiliary subunits was also observed, when endocytosis of AMPARs was directly stimulated by application of insulin, suggesting that the effect on endocytosis is not restricted to constitutive turnover. These novel data indicate that association with auxiliary subunits protects AMPARs from rapid recycling processes, in effect stabilizing the extrasynaptic receptor pool. Noteworthy, TARPɣ8 and CKAMP44a exhibit a similar capacity to increase surface lifetime of AMPARs, suggesting that they employ a similar mechanistic avenue to inhibit endocytosis despite belonging to different protein families. In summary, we provide here new insight into the local dendritic turnover of AMPAR in hippocampal neurons, demonstrating that association of receptors with auxiliary subunits affects their propensity to be rapidly incorporated and recycled. It will be highly interesting to explore how auxiliary subunits mechanistically delay endocytosis in future experiments.Glutamat gesteuerte AMPA Rezeptoren (AMPAR, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate auf englisch genannt) bilden Kationenkanäle, die sich in glutamatergen Synapsen im zentralen Nervensystem von Wirbeltieren befinden. AMPA Rezeptoren sind hauptsächlich für die schnelle Komponente des postsynaptischen Stroms verantwortlich. Die regulierte Bereitstellung des AMPA Rezeptors auf der Zelloberfläche und die entsprechende Wiederaufnahme in die Zelle sind wichtige Prozessen für die synaptische Akkumulation von Rezeptoren, die synaptische Homöostase und Neurotoxizität. Der regulierte Transport an die Plasmamembran und die Wiederaufnahme des AMPA Rezeptors sind für die synaptische Akkumulation von Rezeptoren, die synaptische Homöostase, und Neurotoxizität entscheidend. Auch wenn grundsätzlich beschrieben ist, dass AMPA Rezeptoren in einem ständigen Zyklus zwischen Plasmamembran und intrazellulärem Bereich durch Exo- und Endozytose wechseln (Ehlers*, 2000; Yudowski et al., 2007), sind viele Fragen über die Dynamik und Regulierung dieses Prozesses ungelöst. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich im wesentlichen mit der Dynamik von AMPA Rezeptoren im dendritischen und somatischen Bereichs von hippokampalen Neuronen der Maus in Kultur. Dazu wurden mit bildgebenden Verfahren (live cell imaging) und unter Verwendung genetischer Marker (englisch: Tag) die AMPA Rezeptoren visualisiert und ihre Membranrecycling als Zeitverlauf gemessen und analysiert. Um den Transport der AMPA Rezeptoren (Glutamate Ionotropic Receptor AMPA subtype1 (GRIA1)) in Transportorganellen zu untersuchen, haben wir GRIA1 (Untereinheit des AMAPA Rezeptors) mit pH-abhängigem Green Fluorescent Protein (GFP), auch Superecliptic Phluorin (SEP) genannt, N-Terminal fusioniert. SEP Fluoreszenz ist im saueren Medium der Transportorganellen unterdrückt, emittiert jedoch zunehmend Licht, wenn der pH Wert des Mediums ansteigt, was während der Exozytose der Fall ist. Es zeigte sich, dass die Mehrheit der AMPA Rezeptoren (>80 %) von Recycling Endosomes in nahliegende Abschnitte der Plasmamembran durch Exozytose eingefügt werden. Interessanterweise konnten wir beobachten, dass die Exozytoseereignisse, bestimmt als Fluoreszenzzunahme, sehr variabel sowohl im zeitlichen Verlauf als auch der Intensität der Fluoreszenz waren, was auf verschiedene Fusionstypen hinweist. Auffällig war ein häufig auftretender Fluoreszenzabfall unmittelbar nach Exozytose, den wir als Reazidifizierung nach Endozytose des zuvor exozytierten Vesikels (recycling Endosome) interpretieren. Um diese Hypothese zu prüfen, haben wir selbstmarkierende Tags für Pulse-Chase Experimente kloniert. Mit Hilfe des N-Terminalien HaloTag-GRIA1 Fusionsproteins, haben wir eine akute Färbungsprozedur etabliert um den Bestand an Oberflächen- AMPA Rezeptoren in Neuronen zu markieren. HaloTag-GRIA1 exprimierende Neurone wurden kurzzeitig mit fluoreszierenden Membranimpermeblen Liganden inkubiert. Durch die entstehende kovalente Bindung zwischen Tag und Ligand entsteht eine spezifische Färbung. Gleichzeitig wurde ein Fluoreszenz markierter Synapsen-Marker benutzt. So konnte das Schicksal von markiertem HaloTag-GRIA1 sowohl in den Synapsen als auch im extrasynaptischen Bereich verfolgt werden. Es hat sich über die letzten Jahre gezeigt, dass native AMPA Rezeptoren generell mit auxiliar (Helfer) Untereinheiten assoziieren, die die Kanal Funktion modulieren und den vorwärts Transport des Proteins vom endoplasmatisches Retikulum zur Plasmamembran fördern. Es wurde gezeigt, dass zwei bekannte auxiliare Untereinheiten, TARPɣ8 und CKAMP44a, die Funktion der AMPA Rezeptoren in hippokampalen Neurone modulieren (Khodosevich et al., 2014; Rouach et al., 2005). Anscheinend helfen diese Untereinheiten bei der Verankerung der AMPA Rezeptoren in den Synapsen. Wenig ist hingegen über den Einfluss der Helferuntereinheiten auf das lokale Recycling der Rezeptoren bekannt. Deshalb haben wir den Effekt der beiden Helferuntereinheiten auf den Transport der AMPA Rezeptoren bei basale neuronaler Aktivität untersucht. Wir haben die Helferuntereinheiten zu diesem Zweck überexprimiert und das Verhalten der AMPA Rezeptoren mit Live Imaging beobachtet. Überraschenderweise war die Oberflächenexpression der AMPA Rezeptoren mit der Überexpression der TARPɣ8 oder CKAMP44a nicht verändert, wohingegen das Rezeptor Recycling stark beeinflusst war. Erstens war die Fusionsrate von AMPA Rezeptor enthaltenden Transportorganellen mit der Plasmamembran stark verringert. Diese Veränderung war mit einer reduzierten Anzahl von Recycling Endosomen verbunden, was ein reduziertes Recycling der AMPA Rezeptoren nahelegt. Zweitens konnten wir beobachten, dass die Endozytose der AMPA Rezeptoren bei Überexpression der Helfer Untereinheiten ebenfalls stark reduziert war, was durch die verlangsamte Internalisierung der HaloTag-GRIA1 unter basale Bedingungen gezeigt werden konnte. Die Effekte der Helferuntereinheiten waren auf die extrasynaptischen Bereiche beschränkt, was synapsenspezifische Effekte, wie eine stärkere Verankerung der AMPA-Rezeptoren, als Ursache des reduzierten Recyclings ausschließt. Die Helferuntereinheiten entfalteten ihre Effekte nicht nur bei basaler neuronaler Aktivität. Bei Stimulation mit Insulin trat die gleiche inhibitorische Wirkung auf das Recycling von AMPA Rezeptoren auf, was dafür spricht, dass Helferuntereinheiten eine Rolle in aktivitätsabhängiger als auch in konstitutiven Endozytose spielen. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass die Assoziierung von auxiliar Untereinheiten die AMPA Rezeptoren vor einer schnellen Endozytose schützen, um auf diese Weise das extrasynaptische Rezeptorenangebot zu stabilisieren. Obwohl TARPɣ8 und CKAMP44a zu zwei verschiedene Proteinfamilien gehören, zeigen sie eine vergleichbare Fähigkeit die Lebensdauer der AMPA Rezeptoren auf der neuronalen Oberfläche zu vergrößern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir einen Einblick in das lokale Recycling von AMPA Rezeptoren in den Dendriten der hippokampalen Neurone gewonnen haben. Wir konnten zeigen, dass mit Hilfe der auxiliar Untereinheiten das Recycling von AMPA Rezeptoren verlangsamt wird. In der Zukunft wird es sehr interessant sein, die Mechanismen, die hinter der verzögerten Endozytose von AMPA Rezeptor liegen zu entschlüsseln