The effect of scaffold/surface and culture conditions on differentiation of selected osteoprogenitor cells

W ostatnim półwieczu doszło do błyskawicznej eksplozji użycia implantów medycznych. Do grupy substytutów zastępujących naturalnie występujące tkanki lub organy można zaliczyć: rozruszniki serca, inserty piersiowe czy też zębowe, a także sztuczne stawy biodrowe. Kość jest drugą po krwi najczęściej przeszczepianą tkanką. Często brak dobrej jakości materiału autologicznego u pacjentów cierpiących na poważne defekty kostne i ryzyko związane ze stosowaniem u nich przeszczepów allogennych, zmuszają ortopedów do poszukiwania alternatywnych sposobów terapii. Naprzeciw tym wyzwaniom od kilku lat stara się wychodzić inżynieria tkankowa, wspierana nauką o materiałach. Założeniem tej dziedziny jest połączenie trzech elementów: komórek, podłoża 3D oraz czynników wzrostu i/lub hormonów. Rusztowania 3D wykonane z danego typu biomateriału można łatwo zasiedlać komórkami pobranymi od pacjenta, a następnie hodować w warunkach in vitro stymulując komórki odpowiednimi biocząsteczkami i na powrót wprowadzać je w postaci trójwymiarowego konstruktu kostnego do organizmu. Kość ma złożoną budowę, w której wyróżnia się system połączonych ze sobą kanalików wyścielonych przede wszystkim przez osteocyty. Na skutek przyłożonego z zewnątrz ładunku mechanicznego, przez sieć tę przepływa płyn tkankowy, oddziałujący na położone w jej obrębie komórki. Odtwarzanie naturalnych bodźców mechanicznych w warunkach in vitro jest możliwe dzięki intensywnemu rozwojowi bioreaktorów.Celem niniejszej pracy była analiza procesu wzrostu i różnicowania w kulturze 3D dwóch rodzajów komórek o wysokim potencjale osteogennym: linii MG-63-wyprowadzonej z ludzkiej osteosarkomy i linii hESMP002.5, ludzkich progenitorów mezenchymalnych pochodzenia embrionalnego. Komórki te hodowano w warunkach 3D, w rusztowaniach: poliuretanowych (PU), a także opartych o strukturę kopolimeru glikolidu i L-laktydu (PLGA) oraz PLGA z dodatkiem 21% bioaktywnego szkła, odpowiednio: A2-o wysokiej zawartości wapnia, jak też S2-o dużej zawartości krzemionki. Badania prowadzono wyłącznie w warunkach statycznych, jak też statycznych i dynamicznych (przykładanie perfuzyjnego przepływu pożywki hodowlanej w bioreaktorze, (z ang. tzw. „perfusion flow”)). Eksperymenty przeprowadzone w warunkach statycznych w konstruktach opartych o strukturę PLGA wykazały podobną biozgodność tych materiałów w kontakcie z komórkami linii MG-63. Konstrukty wzbogacone w bioaktywne szkła istotnie poprawiają różnicowanie wspomnianych komórek, tj. mineralizację macierzy zewnątrzkomórkowej oraz syntezę kolagenu. Statystycznie wyższą mineralizację uzyskano także dla tych konstruktów w warunkach dynamicznych w porównaniu ze statycznymi.Badania prowadzone w środowisku statycznym z udziałem komórek linii hESMP002.5 wykazały brak ich odpowiedzi na rhBMP-2, bez względu na obecność (hodowla surowicza) lub brak surowicy (hodowla bezsurowicza) w medium hodowlanym. Obserwowano go niezależnie od zastosowanych warunków hodowli (2D vs 3D). Doświadczenia w kulturach dynamicznych z udziałem tych samych komórek wykazały, iż ich odpowiedź jest zależna od obecności deksametazonu, prędkości przepływu, typu bioreaktora, a także liczby zastosowanych sesji przepływowych. W kulturach krótkoterminowych, optymalną do indukcji osteogenezy w tych komórkach prędkością przepływu medium okazało się być: 12ml/min w systemie Ibidi i 5ml/min, w systemie Watson-Marlow. Przy tych prędkościach, po stymulacji deksametazonem uzyskano odpowiednio wyższą, niż w warunkach statycznych specyficzną aktywność ALP, mineralizację lub/i produkcję kolagenu. Wykonane eksperymenty pozwoliły na scharakteryzowanie potencjału osteogennego dwóch rodzajów osteoprogenitorów w zależności od typu podłoża i środowiska hodowli. Mogą zatem służyć jako model w inżynierii tkanki kostnej. W przyszłości możliwe jest jego potencjalne wykorzystanie w próbach z udziałem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, a następnie po odpowiednich modyfikacjach uwzThe past half century has resulted in an explosive growth in the use of medical implants. Substitutes of tissues or organs vary from pace makers, breast and dental inserts, through implantable hearing aid and artificial hip joints.Bone is a second, after blood most frequently grafted tissue. As there are many limits concerning the use of auto- or allografts in serious bone defects-affected patients, orthopaedic surgeons seek safer and better alternatives of treatment. This is a tissue engineering field supported by material science, trying to face this problem. The main idea of tissue engineering is to combine three elements: cells, 3D matrices, growth factors and/or hormones. 3D scaffolds made of specific types of biomaterials can be easily loaded with patient-derived cells, cultured in vitro and stimulated with appropriate biomolecules, and next reintroduced to an organism as a 3D bone construct. Bone is a complicated structure made up of a network of interconnected channels containing mainly osteocytes and interstitial fluid. When a mechanical load is applied, a tissue-fluid movement induces a physical force affecting the bone cells. The reflection of physiological dynamic forces present in bone is possible in experimental conditions thanks to bioreactors. The aim of this work was to analyse 3D growth and differentiation processes of two osteogenic cell lines: MG-63, derived from human osteosarcoma and hESMP002.5 cells, human embryo-derived mesenchymal progenitors. Both types of cells were cultured in scaffolds made up of polyurethane (PU), plain poliglycol-L-lactide copolymer (PLGA) or PLGA combined with 21% high-calcium (A2) or high-silica (S2)-content bioactive glasses. The experiments were carried-out in static or mixed- static and dynamic conditions (the exposure of the scaffolds to medium perfusion flow). Static experiments with PLGA-based scaffolds shown their similar biocompatibility in the contact with MG-63 cell line. On the other hand, osteoinductive properties of copolymer-bioactive glass composites were shown in a context of tissue differentiation measured as a specific calcium and collagen production. Higher mineralization was also obtained from a dynamic experiment with MG-63 cells grown on PLGA-bioactive glass composites, comparing to a static culture. In static experiments with hESMP002.5 cell line, none rhBMP-2 response of these cells was noted, regardless of the serum presence in a culture medium (‘serum-containing’, SC vs ‘serum-free’, SF) and a culture system applied: 2D vs 3D. In ‘perfusion flow’ experiments with the same line of cells, their dexamethasone presence-, bioreactor type-, flow-rate- and session repeats-dependent response was demonstrated. In the Ibidi system, optimal osteogenesis in the presence of Dex was observed at the flow rate of 12ml/min, whilst for the Watson-Marlow pump at 5ml/min. At this flow rates, significantly higher specific ALP, mineralization and/or collagen production was noted. The data presented below enabled a characterisation of surface- and culture condition-dependent differentiation of two osteogenic-like cell lines and hopefully contributed as a model, that may be potentially used in a bone tissue engineering and future clinical trials with human mesenchymal stem cells