Impact of selected abiotic (ethylene, TDZ) and biotic (endophytic microorganisms) factors on in vitro morphogenesis and biochemical activity of Hypericum perforatum L.

Hypericum perforatum L. jest pospolitą byliną klimatu umiarkowanego Eurazji i gatunkiem introdukowanym, w tym inwazyjnym, na innych kontynentach. Zawartość licznych metabolitów wtórnych, w tym hiperycyny, hiperforyny i ich pochodnych, polifenoli, kwasów fenolowych i flawonoidów sprawia, że ziele dziurawca jest jednym z najbardziej cenionych na świecie źródeł farmaceutyków pochodzenia naturalnego, a także źródłem rzadkich i specyficznych związków chemicznych, wykorzystywanych jako leki przeciwdepresyjne, przeciwnowotworowe, przeciwdrobnoustrojowe oraz immunomodulujące. Surowiec zielarski, Herba hyperici, pozyskiwany jest z kontrolowanych upraw lub zbierany z dziko występujących populacji, a w ostatnich dekadach prowadzone są nad nim również badania w kulturach in vitro, które mają na celu zwiększenie produkcji metabolitów wtórnych. W niniejszej pracy długoterminowe, ustabilizowane kultury dziurawca zebranego z dwóch populacji na krakowskich łąkach, wyprowadzone na pożywce MS suplementowanej tidiazuronem (TDZ), syntetycznym fitohormonem o działaniu analogicznym do cytokininy, poddawano działaniu inhibitora syntezy etylenu (AVG), antagonisty receptorów etylenu (AgNO3) oraz bezpośredniego prekursora etylenu ACC w dwóch stężeniach. Modyfikowano także stężenie TDZ i mieszanki składników MS oraz podawano do podłoża kwas askorbinowy jako egzogenny antyoksydant. Doświadczenia miały na celu poprawę jakości kultur, w których obserwowano zmiany nekrotyczne powstających regenerantów oraz reakcję stresową w postaci czerwonych przebarwień tkanek. Badano również poziom hiperycyny i hiperforyny (HPLC-MS), związków fenolowych (Folin-Ciocâlteu) oraz aktywność antyoksydacyjną (DPPH) w ekstraktach z korzeni, liścieni, liści i łodyg siewek i młodych roślin H. perforatum uzyskanych z nasion zebranych z populacji dzikiej i dostępnych komercyjnie, a także wpływ organizmów endofitycznych na zmianę profilu chemicznego korzeni, łodyg i liści dziurawca (spektroskopia FT-Ramana) z populacji dzikiej. Długotrwałe pozbawienie kultur TDZ wpłynęło negatywnie na liczbę tworzonych pędów przybyszowych na tkance kalusowej, przy jednoczesnej poprawie kondycji uzyskiwanych regenerantów, natomiast krótkotrwałe pozbawienie wpływu TDZ na kultury stymulowało wzrost tkanki kalusowej i mikropropagację. Zaburzenie gospodarki etylenowej, w tym inhibicja i potencjalne wzmocnienie syntezy etylenu nie wpłynęły istotnie na potencjał morfogenetyczny ale w obu przypadkach obniżyły jakość powstających pędów przybyszowych. Dodatek kwasu askorbinowego nie poprawił potencjału morfogenetycznego i nieznacznie pogorszył jakość kultur. Bardzo istotne w regeneracji i odpowiedzi na podawane czynniki okazało się pochodzenie materiału roślinnego. Analiza histologiczna potwierdziła występowanie organogenezy pośredniej via callus w kulturach dziurawca prowadzonych na pożywce z dodatkiem tidiazuronu, a także organogenezy bezpośredniej w kulturach założonych z regenerantów uzyskanych z wyjściowej kultury. Zawartość metabolitów wtórnych oraz aktywność antyoksydacyjna wzrastały wraz z wiekiem siewek, a ich poziom był wyższy w roślinach komercyjnych, w porównaniu z roślinami pochodzącymi z dzikich populacji. Widma spektralne organów roślin zainokulowanych endofitami różniły się od widm roślin kontrolnych, a najbardziej odstające od wszystkich były widma organów roślin zainokulowanych grzybem Epicoccum nigrum. Duża różnorodność chemotypów dziurawca, która zależy od warunków środowiska może wiązać się z heterogennością surowca zielarskiego, a nieustanne zapotrzebowanie na ziele dziurawca może przyczynić się do eksploatacji populacji dzikich, dlatego też przyszłością dla tego gatunku mogą okazać się kultury in vitro, które pozwolą uzyskiwać i izolować metabolity wtórne oraz będą wspomagać selekcję roślin do wykorzystania w kontrolowanych uprawach.Hypericum perforatum L. is a perennial herb occurred in the temperate climate in Eurasia and in the other continents it is an introduced, invasive species. The content of numerous secondary metabolites, including hypericin, hyperforin and their derivatives, polyphenols, phenolic acids and flavonoids make St John’s wort one of the most valued sources of natural-derived pharmaceuticals and rare, specific chemicals using as an anti-depressant, anti-cancer, anti-microbial and immunomodulating drugs. The raw material, Herba hyperici is obtained from the controlled cultivations or harvested from the wild populations. Recent decades research has also been carried out in in vitro cultures aimed at increasing the production of secondary metabolites. In this study the long-term, stabilized cultures of St John’s Wort obtained from two natural sites on meadows in Kraków were used. These cultures was cultivated on MS medium supplemented with thidiazurone (TDZ), a synthetic phytohormone with analogous mechanism of action to cytokinines. Cultures were treated with the inhibitor of ethylene synthesis (AVG), ethylene-receptors antagonists (AgNO3) and direct ethylene precursor (ACC) in two concentrations. Moreover TDZ and MS compound mix concentration were also modified and the ascorbic acid was added to medium as an exogenic antioxidant. The aim of this experiments was to improve quality of the cultures in which necrotic changes in regenerants and stress reactions (red coloration of tissues) were observed. The level of hypericin and hyperforin in extracts from roots, cotyledons, leaves and shoots of wild and commercial seedlings and young plants was tested by HPLC-MS, phenolic compounds was examined by Folin- Ciocâlteu reagent and antioxidant activity was assessed by DPPH assay. The last part of the experiment was to verify the impact of endophytic organisms on phytochemical profile of roots, shoots and leaves of plants germinated from wild seeds by FT-Raman spectroscopy. Long-term deprivation of TDZ cultures negatively affected the number of adventitious shoots formed on callus tissue while improving the condition of the resulting regenerants, whereas short-term deprivation of TDZ effects on cultures stimulated callus tissue growth and micropropagation. Disruption of ethylene metabolism, including inhibition and potential enhancement of ethylene synthesis, did not significantly affect morphogenetic potential but in both cases improved the quality of the resulting adventitious shoots. The addition of ascorbic acid did not improve morphogenetic potential and slightly impaired the quality of the cultures. The origin of the plant material proved to be very important in the regeneration and response to the factors administered. Histological analysis confirmed the occurrence of indirect organogenesis via callus in St. John's wort cultures cultivated on medium supplemented with thidiazuron, as well as direct organogenesis in cultures established from regenerants obtained from the initial culture. Secondary metabolite content and antioxidant activity increased with seedling age, and their levels were higher in commercial plants, compared to plants from wild populations. The spectral spectra of the organs of endophyte-inoculated plants differed from those of control plants, with the spectra of organs of plants inoculated with the fungus Epicoccum nigrum being the most outlier of all. The high diversity of St John's wort chemotypes, which depends on environmental conditions, may be related to the heterogeneity of the herbal raw material, and the continuous demand for St John's wort herb may contribute to the exploitation of wild populations, so in vitro cultures may be the future for this species to obtain and isolate secondary metabolites and support plant selection for use in controlled cultivation