Untersuchung der intrazellulären Verteilung, Zytotoxizität und Genexpressionsveränderungen spezifischer Gene

Purpose: Triplex-forming-oligonucleotides (TFOs) are able to bind DNA in a sequencespecific manner and are a promising tool to manipulate genes or gene regulatory units in a cellular environment. TFOs posses also a therapeutic potential e.g. as a carrier molecule for Alpha- or Auger-electron-emitter (AEE) to target specific DNA sequences in tumor cells. A method for the effective labeling of TFOs with the AEE iodine-125 (I-125) was established and the ability of I-125-labeled TFOs to induce site-specific double-strand breaks (DSB) in DNA was investigated. Moreover analysis of the influence of I-125-labeled TFOs in transfected SCL-II cells with regard to cell survival, DNA damage and the induction of cell cycle arrest were performed. Furthermore the ability of I-125-labeled TFOs to alter gene expression of targeted genes was examined. Methods: For that purpose two groups of TFOs were designed – TFOs specific for single targets in the genes BCL2, BRCA1 and GAPDH and multi-binding TFOs with several thousand binding sites in the whole genome. The cellular distribution and persistence of TFOs was analyzed via flow cytometry and the I-125 labeling was performed using a modified primer extension method. Cell survival was analyzed with the colony forming assay. DNA DSB were determined using the 53BP1 assay and the micronucleus assay. The analysis of cell cycle was done after 7-aminoactinomycin D (7-AAD) cell staining by flow cytometry. Gene expression alteration of targeted genes was tested via quantitative Real-Time PCR with RNA isolates from transfected SCL-II cells. Results: A persistence of intact TFOs in a cellular environment for at least 72 h could be confirmed. For all tested I-125-labeled TFOs an increased cytotoxicity and DNA damaging potential was detected. Moreover, the degree of cytotoxicity seemed to depend on target localization as well as on target quantity. A pronounced induction of cell cycle arrest in G2/M-phase 8 h post-transfection could also be detected. The genespecific binding of I-125-labeled TFOs led to a significant down-regulation of GAPDH and an almost 2-fold up-regulation of BCL2 gene expression. The BRCA1 gene expression did not show any alteration. Conclusions: The magnitude of an I-125-labeled TFO induced cytotoxic effect can be influenced by the total number of targets as well as by the distinct location of a single target. Therefore targeting many non-crucial targets can be as cytotoxic as targeting one single, but crucial target and vice versa. Additionally, single gene targeting can alter gene expression in a gene-specific manner.Einleitung: Triplex-forming-oligonucleotides (TFOs) sind in der Lage an die DNA sequenzspezifisch zu binden und repräsentieren daher ein vielversprechendes Werkzeug um Gene oder genregulatorische Mechanismen auf zellulärer Ebene zu manipulieren. Darüber hinaus verfügen TFOs auch über ein therapeutisches potential z.B. als Transportmolekül für Alpha- oder Auger-electron-emitter (AEE) zur gezielten Manipulation spezifischer DNA Sequenzen in Tumorzellen. Eine effiziente Methode zur Markierung von TFOs mit dem AEE Iod-125 (I-125) wurde etabliert und es konnte gezeigt werden, dass I-125-markierte TFOs in der Lage sind spezifische Doppelstrangbrüche in der DNA hervorzurufen. Darüber hinaus wurde die Wirkung I-125-markierter TFOs in transfizierten SCL-II Zellen untersucht, wobei ein besonderer Fokus auf das Zellüberleben, DNA Schäden und Veränderungen im Zellzyklus gelegt wurden. Außerdem sollte geklärt werden ob I-125-markierte TFOs in der Lage sind gezielt die Genexpression bestimmter Gene zu verändern. Methoden: Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche TFO-Gruppen erstellt. Zum einen TFOs mit einer einzigen Zielsequenz jeweils in den Genen BCL2, BRCA1 und GAPDH und zum anderen mehrfach bindende TFOs mit mehreren tausend Bindestellen im gesamten Genom. Die zelluläre Verteilung und Stabilität von TFOs wurde mittels Duchflusszytometrie untersucht. Die Markierung der TFOs mit I-125 erfolgte anhand einer modifizierten Version der Primer-Extension-Methode. Das Zellüberleben wurde mit Hilfe des Colony Forming Assay (CFA) untersucht und DNA Schäden wurden mittels 53BP1 Assay und der Mikrokern-Analyse bestimmt. Die Untersuchung des Zellzyklus konnte nach 7-AAD Färbung mit durch-flusszytometrischen Methoden bestimmt werden. Durch die Überprüfung von RNA Isolaten aus transfizierten Zellen durch quantitative Real-Time PCR, konnten potentielle Genexpressionsänderungen nachgewiesen werden. Ergebnisse: Es konnte nachgewiesen werden, dass intakte TFOs in zellulärer Umgebung bis zu 72 Stunden persistieren. Alle untersuchten I-125-markierten TFOs zeigten eine erhöhte Zytotoxizität und Schadensinduktion. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Grad der Zytotoxizität sowohl von der Qualität als auch von der Anzahl der TFO-Bindestellen abhängt. Ein deutlicher Einfluss auf den Zelluzyklus verlauf, mit einem G2/M-Block 8 h nach Transfektion, konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Die genspezifische Anlagerung von I-125-markierten TFOs führte zu einer signifikanten Herunterregulation der GAPDH-expression und zu einer annähernd zweifachen Hochregulation der BCL2 Genexpression. Bei BRCA1 konnte keine Veränderung der Genexpression festgestellt werden. Fazit: Die Stärke der von I-125-markierten TFOs induzierter Zytotoxizität kann sowohl von der gesamten Anzahl an TFO-Bindestellen als auch von der spezifischen Positionierung eines einzelnen TFOs beeinflusst werden. Daraus lässt sich folgern, dass I-125-TFOs, die nur an einer, aber essentiellen Bindestellen gebunden sind ein ähnliches zytotoxisches Potential entfalten können wie I-125-TFOs die an mehreren aber nicht-essentiellen Bindestellen gebunden sind