Identifizierung und funktionelle Charakterisierung regulatorischer Risikovarianten und neuer Signalwege für das Pseudoexfoliationssyndrom/-glaukom

Pseudoexfoliation (PEX) syndrome is a complex, genetically determined, fibrotic disorder, which leads to progressive accumulation of abnormal fibrillar aggregates in intra- and extraocular tissues. It represents one of the most frequent causes of chronic open-angle glaucoma. To date, lysyl oxidase-like 1 (LOXL1), coding for a cross-linking matrix enzyme, has been identified as the major effect locus in PEX disease with dysregulated LOXL1 expression representing a pathological hallmark of both PEX syndrome and glaucoma. Although the effect sizes of PEX-associated risk alleles in LOXL1 were found to be exceptionally large (ORs: 3-20 and p-values: 10-30-10-127), they also showed genome-wide significant allele effect reversal in populations with different ancestries, which casts doubt on their potential biological or clinical significance. The purpose of this study, therefore, was to identify and functionally characterize, presumably causal sequence variants, both common and rare variants, at the LOXL1 locus, and determine their impact on gene expression regulation. Since PEX as a complex disease may be caused by additional not yet identified genes, this study also sought to identify further causal genes and biological pathways contributing to PEX pathogenesis by means of a RNA sequencing approach. The first part of this study aimed at analyzing the functional mechanisms, by which a previously identified haplotype of 14 common intronic variants (rs8023330, rs1550436, rs2165241, rs28588430, rs28617339, rs4886778, rs8027022, rs2028386, rs4337252, rs12440667, rs12905253, rs11638944, rs12441130 and rs11631579) in intron 1 and 2 of LOXL1 may influence the risk for PEX syndrome/glaucoma. Experimental evidence showed that this polymorphic locus has enhancer-like function and exerts a cis-acting effect on LOXL1 expression, by modulating alternative pre-mRNA splicing and alternative transcription factor binding. In particular, one of the single nucleotide polymorphisms (SNPs), rs11638944C>G, was found to act as an expression quantitative trait locus, which causes reduced LOXL1 mRNA levels in cells and tissues of risk allele carriers. This was achieved by enhancing alternative splicing coupled with nonsense-mediated decay (NMD), and by reducing the binding of the transcription factor retinoid X receptor alpha (RXRα). Subsequently, the alternatively spliced transcript LOXL1-a was confirmed as target of the NMD pathway, which was established as a novel dynamic mode to adapt LOXL1 expression levels to various PEX-associated environmental and nutritional cues, such as oxidative stress, caffeine and retinoic acid. In the second part of this study, a novel common, non-coding sequence variant, rs7173049A>G, identified through a cooperative LOXL1 deep re-sequencing approach by the International PEX Genetics Consortium, was analyzed. This hitherto unique variant is located downstream of LOXL1, with the minor allele being consistently enriched in controls across populations of different ancestry (OR=0.63, p=6.33x10-31), translating to a protective effect. Functional analysis using CRISPR/Cas9 genome editing provided evidence of an enhancer-like regulatory activity of the genomic region surrounding rs7173049, influencing transcriptional regulation of two neighboring genes, i.e. stimulated by retinoic acid receptor 6 (STRA6) and immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein 2 (ISLR2). Further in-depth analyses showed that the protective allele G of rs7173049 correlates with enhanced tissue expression levels of STRA6 and ISLR2 and that both genes, together with other key components of the retinoic acid receptor-mediated signaling pathway, are significantly downregulated in PEX tissues. siRNA-mediated downregulation of this pathway induced the expression of PEX-associated matrix genes, including LOXL1, elastin (ELN), fibrillin-1 (FBN1) and transforming growth factor beta 1 (TGFB1), in vitro indicating an involvement of impaired retinoid metabolism in the pathophysiology of PEX syndrome. The deep re-sequencing effort by the International PEX Genetics Consortium has also revealed a spectrum of 63 rare variants in LOXL1, which were mostly enriched in controls over PEX cases. In particular, one of these rare variants, rs201011613A>T (p.Y407F), which is located in the oxidase domain of LOXL1, showed a remarkably strong evidence of protection against PEX on a genome-wide level, conferring a 25-fold resistance to disease (p=7x10-14). The third part of this study, therefore, was devised to characterize potential consequences of the amino acid exchange of tyrosine to phenylalanine at position 407 of LOXL1 on protein function, including catalytic activity, aggregation and protein interaction. It could be demonstrated that LOXL1 variants harboring the rare protective allele T revealed a significantly increased binding affinity to fibulin-4, a key molecule in elastogenesis. Although the p.Y407F variant had no effect on protein aggregation and enzymatic activity, LOXL1 could be confirmed as an aggregation-prone protein, and it could be shown that the catalytic activity was affected by the two classical common non-synonymous variants rs1048661G>T (p.R141L) and rs3825942G>A (p.G153D). To determine additional disease-causing biological pathways and processes and their potential relationship to LOXL1, a pilot RNA sequencing study using two PEX-relevant tissue types, i.e. iris and lens capsule/epithelium of PEX and control patients, was performed in the last part of this study. Statistical analysis revealed 207 differentially expressed genes (DEGs) in iris and 1553 DEGs in lens capsule/epithelium specimens (adjusted p-value +1 or <-1). Validity of DEGs detected by RNA-sequencing was confirmed by means of specific qPCR assays using known PEX-related genes including LOXL1. Subsequent pathway analysis resulted in a total of 16 different functional clusters reflecting interesting biological processes with a potential relevance for PEX pathophysiology. The clusters “Extracellular matrix organization and cell-matrix interaction”, “Inflammatory response”, “Hemostasis and coagulation” and “Calcium signaling” proved as the top four functional clusters emerging in PEX tissues. Further, in-depth analyses of candidate genes emerging from this profiling approach highlighted the importance of inflammatory cascades, cell-matrix interactions and integrin regulation in the complex pathophysiology of PEX syndrome and glaucoma. In conclusion, the present study uncovered functional molecular mechanisms of how common and rare variants at LOXL1, the major susceptibility gene for PEX syndrome/glaucoma, influence expression and protein function of LOXL1 and of two neighboring genes, STRA6 and ISLR2. Moreover, it also identified novel biological pathways, such as retinoic acid signaling, that contribute to the pathogenesis of this complex disease. This work not only increased our understanding of the molecular pathomechanisms underlying PEX disease, but may also provide a basis for the development of future interventional strategies to eventually improve clinical diagnosis, genetic testing, risk prediction and personalized treatment for one of the most frequent causes of glaucoma.Das Pseudoexfoliations (PEX)-Syndrom ist eine komplexe, genetisch determinierte, fibrotische Erkrankung, in deren Verlauf es zur progressiven Ablagerung abnormaler fibrillärer Aggregate in intra- und extraokulären Geweben kommt. Es ist eine der häufigsten Ursachen für ein chronisches Offenwinkelglaukom. Als wichtigster genetischer Risikofaktor gilt Lysyloxidase-like 1 (LOXL1), das für ein quervernetzendes extrazelluläres Matrixenzym kodiert. Eine dysregulierte Expression von LOXL1 gilt als zentrales pathologisches Kennzeichen für PEX Syndrom und Glaukom. Trotz ungewöhnlich hoher Effektstärken der assoziierten LOXL1 Risikoallele (OR: 3-20; p-Wert: 10-30-10-127) konnte das Phänomen des genomweit signifikanten „allele flipping“ in bestimmten Bevölkerungsgruppen bislang nicht gelöst werden, so dass ein kausaler Zusammenhang der bekannten Risikoallele mit der PEX-Pathogenese fraglich bleibt. Das Ziel dieser Studies war es daher, neue, mutmaßlich kausale, häufige und seltene Varianten im LOXL1 Locus zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren. Da PEX eine komplexe genetische Erkrankung ist, wird zudem vermutet, dass es neben LOXL1 noch weitere, bislang noch nicht identifizierte Gene gibt, die zur Entstehung der Krankheit beitragen. Daher beschäftigte sich diese Studie auch mit einer Transkriptionsanalyse PEX-relevanter Gewebe mittels RNA Sequenzierung um weitere Gene und Signalwege, die zur Krankheitsentstehung beitragen, zu identifizieren. Der erste Teil dieser Studie analysierte die funktionellen Mechanismen eines bereits mit PEX-assoziierten Haplotyp, bestehend aus 14 häufigen nicht-kodierenden Varianten (rs8023330, rs1550436, rs2165241, rs28588430, rs28617339, rs4886778, rs8027022, rs2028386, rs4337252, rs12440667, rs12905253, rs11638944, rs12441130 and rs11631579), im ersten und zweiten Intron von LOXL1. Die Untersuchungen ergaben, dass dieser polymorphe Locus einen Enhancer-Effekt zeigt und die Expression von LOXL1 durch Modulation des alternativen pre-mRNA Spleißens und differentielle Tranksriptionsfaktorbindung beeinflusst. Insbesondere die Variante rs11638944C>G korrelierte mit einer verminderten LOXL1 mRNA Expression in Zell- und Gewebeproben von Trägern der Risikoallele. Die zugrundeliegenden Mechanismen beinhalten die verstärkte Transkription einer alternativ gespleißten mRNA (LOXL1-a) und deren Abbau durch „Nonsense-mediated decay“ (NMD) sowie die reduzierte Bindung des Trankriptionsfaktors Retinoid X receptor alpha (RXRα) an die Risiko-Sequenz im LOXL1-Gen. In einer Folgestudie konnte das alternativ gespleißte Transkript LOXL1-a als Ziel des regulatorischen NMD-Signalwegs bestätigt und dessen Modulation durch Stressfaktoren dokumentiert werden. Damit wurde ein neuer dynamischer Regulationsmechanismus beschrieben, der die Expression von LOXL1 als adaptive Stressantwort auf verschiedene PEX-assoziierten Umwelt- und Ernährungsfaktoren, wie beispielsweise oxidativer Stress, Koffein und Retinolsäure, reguliert. Im zweiten Teil der Studie wurde eine häufige nicht-kodierende Variante, rs7173049A>G, analysiert, welche downstream von LOXL1 lokalisiert ist und im Rahmen einer kooperativen, gezielten Re-sequenzierung des LOXL1 Locus durch das „International PEX Genetics Consortium“ neu identifiziert wurde. Das seltenere Allel G dieser Variante war durchgängig in gesunden Kontrollen aller Populationen unterschiedlicher Herkunft signifikant mit PEX-assoziiert, was auf einen protektiven Effekt schließen lässt. Funktionelle Analysen mittels CRISPR/Cas9 Genom Editierung konnten zeigen, dass die genomische Region um rs7173049 die Transkription zwei benachbarter Gene, Stimulated by retinoic acid receptor 6 (STRA6) und Immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein 2 (ISLR2), reguliert. Weitere Analysen ergaben, dass das protektive Allel G von rs7173049 mit einer verstärkten Expression von STRA6 und ISLR2 in Gewebeproben korreliert. Gewebe von PEX Patienten zeigten nicht nur eine signifikante Verminderung der Expression von ISLR2 und STRA6, sondern auch von weiteren zentralen Komponenten des Retinolsäure-Signalwegs. Da eine Hemmung des Retinolsäure-Signalwegs mittels siRNA zu einer verstärkten Expression verschiedener PEX-assoziierter Matrix-Gene, wie beispielsweise LOXL1, Elastin (ELN), Fibrillin-1 (FBN1) und Transforming growth factor beta 1 (TGFB1) in vitro führte, kann von einer Beteiligung eines beeinträchtigten Retinol-Metabolismus an der PEX-Pathogenese ausgegangen werden. Die Re-Sequenzierung von LOXL1 durch das „International PEX Genetics Consortium“ deckte zudem 63 seltene PEX-assoziierte Varianten in LOXL1 auf, welche vermehrt in gesunden Kontrollen im Vergleich zu PEX-Patienten vorhanden waren. Insbesondere die Variante rs201011613A>T (p.Y407F), die in der katalytischen Domäne von LOXL1 lokalisiert ist, zeigte eine besonders starke Protektion gegen PEX (p=7x10-14). Der dritte Teil dieser Studie zielt daher darauf ab, potentielle funktionelle Konsequenzen des Aminosäurenaustausches von Tyrosin zu Phenylalanin an Position 407 im LOXL1 Protein in Hinblick auf katalytische Aktivität, Aggregation und Protein-Interaktion, zu untersuchen. Unter Anwendung spezifischer Assays konnte gezeigt werden, dass LOXL1-Varianten mit dem protektiven Allel T eine signifikant stärkere Bindungsaffinität zu Fibulin-4, einer zentralen Komponente der Elastogenese, aufwiesen als Varianten mit dem häufigen Allel A. Auch wenn p.Y407F keinen direkten Einfluss auf die Proteinaggregation und Enzymaktivität hatte, konnte LOXL1 dennoch als Aggregationsbildendes Protein nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die beiden häufigen kodierenden Varianten rs1048661G>T (p.R141L) und rs3825942G>A (p.G153D) die katalytische Aktivität von LOXL1 beeinflussen. Zur Identifizierung weiterer krankheitsrelevanter Signalwege für PEX Syndrom/Glaukom sowie deren Bezug zu LOXL1, wurde im letzten Teil dieser Studie eine RNA Sequenzierung von zwei PEX-relevanten Gewebetypen, Iris und Linsenkapsel/Epithel, von PEX-Patienten und Kontrollen, durchgeführt. Die Analyse der Daten zeigte 207 differenziell exprimierte Gene (DEGs) in der Iris und 1553 DEGs in Linsenkapsel/Epithel (angepasster p-Wert +1 oder <-1). Die Validität der erhaltenen RNA Sequenzierungsdaten wurde mittels qPCR Analysen von bekannten PEX-relevanten Genen, wie beispielsweise LOXL1, bestätigt. Anschließende Signalweg-Analysen ergaben insgesamt 16 verschiedene funktionelle Gencluster, welche interessante biologische Prozesse widerspiegelten, die eine potentielle Relevanz für die PEX Pathophysiologie aufweisen könnten. Die 4 Top-Cluster waren „Extrazelluläre Matrix-Organisation und Zell-Matrix-Interaktion“, „Entzündungsantwort“, „Hämostase und Koagulation“ und „Calcium Signaling“. Eine weiterführende Analyse selektierter Kandidatengene konnte die Relevanz von Entzündungsprozessen, Zell-Matrix Interaktionen und Integrin-Regulation für die komplexe Pathophysiologie des PEX Syndroms/Glaukoms bestätigen. Zusammenfassend konnten im Rahmen der vorliegenden Studie verschiedene funktionelle Mechanismen für den Einfluss häufiger und seltener Varianten im LOXL1-Gen, dem wichtigsten Kandidatengen für PEX Syndrom/Glaukom, auf die Expression und Proteinfunktion von LOXL1 und zwei benachbarter Gene, STRA6 und ISLR2, beschrieben werden. Zusätzlich, wurden neue biologische Signalwege, wie beispielsweise der Retinolsäure-Signalweg, identifiziert, die zur Pathogenese dieser komplexen Erkrankung beitragen. Diese Studie trägt damit nicht nur zum Verständnis der molekularen Pathomechanismen des PEX-Syndroms bei, sondern stellt auch die Grundlage für die zukünftige Entwicklung neuer Therapieansätze und für eine verbesserte klinische und genetische Diagnostik, Risikoabschätzung und personalisierte Behandlung einer der häufigsten Glaukomursachen weltweit