Association of sperm chromatin ultrastructural alterations with sperm head proteomic in bovine (bos taurus)

Changes in sperm chromatin in bulls may interfere with the fertilization process and embryonic development. Several methods are currently used to evaluate sperm chromatin, which use light microscopy to cytometry flow. Transmission electronic microscopy (TEM) has been used most frequently. These methodologies may identify from DNA fragmentation, to the intensity of chromatin compaction, which, if not adequate, makes the DNA susceptible to several damages or may be the morphological expression of epigenetic alterations. The objective of this work was to correlate chromatin alterations identified by TEM with the protein constitution of the bull spermatozoa head. Semen samples from four Girolando bulls were used, which were evaluated by TEM. Part of the samples were also used in in vitro embryo production routines (IVEP) and for analysis in advanced mass spectrometry, obtaining the semiquantitative protein composition of the spermatozoa head. In the TEM evaluation, chromatin compaction changes were divided into two types: mild (presence of up to 6 small clear spots or lighter region occupying up to a quarter of the head) and severe (presence of more than six light spots or occupying clearer region more than a quarter of the nuclear area). To identify possible correlations between the chromatin changes with the fertilization process and the initial embryonic development, the Pearson correlation test was performed between the percentage amount of each type of alteration with the cleavage and blastocyst rates obtained in the IVEPs, respectively. Considering that, dispate to the severe alterations, mild chromatin alterations did not present a significant correlation with the results of the IVEPs, only the existence of a correlation between the protein content of the head and the severe chromatin alterations was evaluated. To identify these correlations, Pearson's correlation test was used between the amount of each protein and the percentage of severe chromatin changes. To identify these correlations, Pearson's correlation test was used between the amount of each protein and the percentage of severe chromatin changes. Among the 766 proteins identified by mass spectrometry, the "60S ribosomal protein L12", "60 kDa heat shock protein", "Acetyl-CoA acetyltransferase", "Cytochrome b-c1 complex subunit 6", "ATP 342 synthase subunit delta "," Limbin "," 40S ribosomal protein S7 "," DNA replication ATP-dependent helicase / nuclease DNA2 "and" Activated CDC42 kinase1 "showed a significant positive correlation with severe chromatin alterations. These proteins may be directly or indirectly participating in the compaction process or only be present in large quantities when optimal conditions for compaction are present. On the other hand, the proteins Serine / threonine-protein phosphatase 2A, 60S ribosomal protein L9, Plasma serine protease inhibitor, Coiled-coil domain-containing protein 63, Signal peptidase complex subunit 3, Serine racemase, , "3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase", "T-complex protein 1 subunit gamma", "Inositol monophosphatase 1", "Monofunctional C1-tetrahydrofolate synthase" showed significant negative correlation with severe chromatin alterations. The presence of these proteins may be directly or indirectly damaging the chromatographic compaction process or even they are only present in large quantities when the conditions for chromatographic compaction are not good. In any case, they have the potential to be used as molecular markers of subfertility and fertility, respectively.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoDissertação (Mestrado)Alterações da cromatina espermática em touros podem interferir no processo de fertilização e no desenvolvimento embrionário. Atualmente são utilizados diversos métodos para a avaliar a cromatina espermática, que usam desde microscopia de luz à citometria de fluxo. Mais recentemente tem sido utilizado microscopia eletrônica de transmissão (MET). Essas metodologias identificam desde fragmentação do DNA, até a intensidade de compactação da cromatina, que se não for adequada, torna o DNA suscetível a diversos danos ou pode ser a expressão morfológica de alterações epigenéticas. Objetivou-se com o presente trabalho correlacionar alterações cromatínicas identificadas por MET com a constituição proteica da cabeça do espermatozoide de touro. Foram utilizadas amostras de sêmen de quatro touros Girolando, as quais foram avaliadas por MET. Parte das amostras também foram utilizadas em rotinas de produção in vitro de embriões (PIVE) e para análise em espectrometria de massa avançada, obtendo-se a composição proteica semiquantitativa da cabeça dos espermatozoides. Na avaliação por MET as alterações de compactação da cromatina foram divididas em dois tipos: leves (presença de até 6 pequenos pontos claros ou região mais clara ocupando até um quarto da cabeça) e graves (presença mais de seis pontos claros ou região mais clara ocupando mais de um quarto da área nuclear). Para identificar possíveis correlações entre as alterações de cromatina com o processo de fertilização e o desenvolvimento embrionário inicial, foi realizado o teste de correlação de Pearson entre a quantidade porcentual de cada tipo de alteração com as taxas de clivagem e de blastocisto obtidas nas PIVEs, respectivamente. Considerando que ao contrário das alterações graves, as alterações cromatínicas leves não apresentaram correlação significativa com os resultados das PIVEs, foi avaliada apenas a existência de correlação entre o conteúdo proteico da cabeça e as alterações cromatínicas graves. Para identificar estas correlações foi utilizado o teste de correlação de Pearson entre a quantidade de cada uma das proteínas e a porcentagem de alterações cromatínicas graves. Dentre as 766 proteínas identificadas pela espectrometria de massa, as proteínas “60S ribosomal protein L12”, “60 kDa heat shock protein”, “Acetyl-CoA acetyltransferase”, “Cytochrome b-c1 complex subunit 6”, “ATP 342 synthase subunit delta”, “Limbin”, “40S ribosomal protein S7”, “DNA replication ATP-dependent helicase/nuclease DNA2” e “Activated CDC42 kinase1” apresentaram correlação positiva significativa com as alterações de cromatina graves. Essas proteínas podem estar participando diretamente ou indiretamente do processo de compactação ou apenas estar presente em grande quantidade quando as condições ideais para compactação estão presentes. Já as proteínas “Serine/threonine-protein phosphatase 2A", “60S ribosomal protein L9”, “Plasma serine protease inhibitor”, “Coiled-coil domain-containing protein 63”, “Signal peptidase complex subunit 3”, “Serine racemase”, “3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase”, “T-complex protein 1 subunit gamma”, “Inositol monophosphatase 1”, “Monofunctional C1-tetrahydrofolate synthase” apresentaram correlação negativa significativa com as alterações de cromatina graves. A presença destas proteínas pode estar prejudicando diretamente ou indiretamente o processo de compactação cromatínica ou mesmo, elas estão apenas presentes em grande quantidade quando as condições para compactação cromatínica não forem boas. De qualquer forma, elas possuem potencial para serem utilizadas como marcadores moleculares de subfertilidade e fertilidade, respectivamente