Study of protein and epigenetic profile of bovine sperm nucleus with impact on in vitro embryo production

A produção in vitro de embriões (PIVE) vem se destacado como biotecnologia reprodutiva nos rebanhos bovinos, porém ainda com algumas limitações. A diferença de fertilidade entre touros é uma delas e dentre os atributos espermáticos que podem impactar na PIVE, pouco se sabe sobre a composição do núcleo espermático. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo principal identificar quais aspectos nucleares do espermatozoide caracterizam a diferença nos índices de PIVE. Para tanto, o estudo foi dividido em 3 experimentos nos quais foi utilizado o banco de dados da empresa In Vitro Brasil para seleção de touros de alta (AF) e baixa (BF) taxa de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocisto/taxa de clivados; n=5 touros/grupo). No primeiro experimento, foi realizado a avaliação da cromatina para susceptibilidade ao desafio ácido (SCSA modificado), deficiência de protaminação (CMA3) e fragmentação do DNA (COMETA). Apenas a deficiência de protaminação apresentou diferença entre os grupos, entretanto a porcentagem de células positivas para o CMA3 foi baixa, não sendo possível atribuir a esta alteração as diferenças de fertilidade encontradas. No segundo experimento, foi realizada a avaliação de proteômica do núcleo espermático destes touros. Para tanto, as amostras foram incubadas com detergente CTAB para remoção de parte da membrana e cauda, extração das proteínas, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massas. A quantificação das proteínas foi avaliada pelo índice iBAQ obtido após a identificação dos peptídeos e a média deste índice comparado entre os grupos para identificação das proteínas diferencialmente expressas. Foram identificadas 196 proteínas, 21 diferencialmente expressas, sendo 17 hiperexpressas no grupo AF e 4 hiperexpressas no grupo BF. Dentre elas, proteínas relacionadas ao processo de espermatogênese, fecundação e motilidade. No terceiro experimento, com objetivo de identificar as marcações epigenéticas relacionadas com a diferença de fertilidade in vitro, foi realizado a avaliação das estruturas de nucleossomos utilizando a enzima MNase para posteriormente utilização na técnica de imunoprecipitação das marcações de histona. Entretanto, não foi identificado a presença de nucleossomos no DNA espermático bovino, inviabilizando análises posteriores. Sendo assim, a avalição da metilação de DNA foi escolhida como marcação epigenética para ser estudada. Neste caso, foi utilizada a técnica de RRBS (reduced representation of bisulfite sequencing) para identificar as citosinas diferencialmente metiladas (CDM) entre os grupos AF e BF. Foram identificadas 440 CDM, sendo 327 hipometiladas e 113 hipermetiladas no grupo AF. Além disto, 184 genes contendo estas CDM foram identificados, entretanto nenhum processo biológico foi enriquecido por estes genes. Foi possível concluir com este trabalho que a fertilidade in vitro pode ser considerada de caráter multifatorial, sendo que alterações pequenas de integridade de cromatina não afetam diretamente, já proteínas relacionadas a espermatogênese, motilidade e fecundação podem ter relação com o fenótipo fertilidade estudado. Dentre as marcações epigenética estudadas, as estruturas de nucleossomo pareceram estar ausentes no espermatozoide bovino, e a metilação de DNA não apresenta impacto significativo no perfil de fertilidade.In vitro embryo production (IVP) has been highlighted as reproductive biotechnique in bovine herds, but still with some limitations. The fertility difference between bulls is one of them and among the sperm attributes that can impact on IVP, little is known about the composition of the bovine sperm nucleus. Therefore, this work had as main goal to identify which sperm nuclear aspects characterize the difference in the IVP index. Then, the study was divided in 3 experiments in which the database of the company In Vitro Brasil was used for selection of bulls with high (HF) and low (LF) embryo development rate (blastocyst rate/cleavage rate; n=5 bulls/group). In the first experiment, chromatin analysis of susceptibility to acid denaturation (modified SCSA), protamine deficiency (CMA3) and DNA fragmentation (COMET assay) were performed. Only protamine deficiency presented difference between groups, however the percentage of CMA3 positive cells was low and it was not possible to attribute to this alteration the fertility difference between groups. In the second experiment, proteomic analysis of the sperm nucleus of these bulls was performed. For that, samples were incubated with CTAB detergent to remove part of the membrane and tail, submitted to protein extraction, trypsin digestion and mass spectrometry analysis. The amount of the proteins was evaluated by the iBAQ index obtained after the identification of peptides and the average of this index compared to identify the differentially expressed proteins. In this experiment, 196 proteins were identified, 21 differentially expressed, being 17 overexpressed in the HF and 4 overexpressed in LF group. Among them, proteins related to the spermatogenesis, fertilization and motility. In the third experiment, in order to identify the epigenetic marks related to in vitro fertility differences it was performed the evaluation of the nucleosome structures using the MNase enzyme to later utilization of immunoprecipitation of the histone marks technique. However, the presence of nucleosomes in bovine sperm DNA was not identified, unfeasible further analysis. Thus, the evaluation of DNA methylation was chosen as epigenetic mark to be studied. In this case, the RRBS (reduced representation of bisulfite sequencing) technique was used to identify the differentially methylated cytosines (DMC) between the two groups. In this experiment, it was identified 440 DMC, being 327 hypomethylated and 113 hypermethylated in HF group. In addition, 184 genes containing these DMCs were identified, however no biological process enrichment was identified with these genes. In conclusion, this study indicated that in vitro fertility characterization can be multifactorial; small changes in chromatin integrity do not directly affect, but proteins related to spermatogenesis, motility and fertilization may be related to the fertility phenotype studied. Among the epigenetic marks studied, nucleosome structures were absent in bovine spermatozoa, and DNA methylation did not have a significant impact on the fertility profile