Identification of the prion protein Doppel in spermatozoa and its impact in fertility

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014O gene PRNP é responsável pela expressão da proteína priónica celular (PrPC), que, após sofrer uma conversão pós-tradução numa isoforma anormal e insolúvel (PrPSc), está associada à transmissão e à patogénese das encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs). Mais recentemente descobriu-se um outro gene, o PRND, que se julga ter resultado da duplicação ancestral do PRNP. O PRND é responsável pela expressão de uma proteína tipo priónica Doppel, que ao contrário da PrPSc, não está associada à propagação de EETs. A proteína Doppel é pouco expressa no cérebro, contrariamente à PrPC, mas é expressa no coração e, principalmente, nas células germinativas e de Sertoli (ratinho, ratazana, suínos, humanos, ovinos e bovinos), nas células de Leydig (caprinos), nas células epiteliais do epidídimo (javali, suínos), e nos folículos ováricos (células da granulosa). Apesar da expressão do gene PRND aparentemente ser constante nas células de Sertoli, a sua expressão ao nível das células germinativas masculinas parece variar bastante. Como tal, diferentes padrões de expressão deste gene podem estar associados não só à espécie, mas também à fertilidade ou infertilidade do macho. Por outro lado, os ratinhos fêmeas PRNDknockout, sem expressão de Doppel, são viáveis e férteis, mas os machos são estéreis, o que sugere que esta proteína possa ter um papel importante na gametogénese e fertilidade masculina. Os machos PRND-knockout têm um comportamento sexual normal, com concentrações de espermatozóides próximas das normais, mas sem capacidade de realizar a reacção acrossómica e de fertilizar os oócitos (não penetram na zona pelúcida). Estudos recentes demonstram que a adição da proteína Doppel ao meio de capacitação aumenta a capacidade de fertilização in vitro de espermatozóides ovinos, reforçando a hipótese desta proteína ter funções ao nível da regulação da função acrossómica e da fertilidade masculina. Resultados anteriores evidenciaram uma associação entre os polimorfismos do gene PRND ovino e a capacidade de fertilização e de crio-resistência dos espermatozóides. No entanto, a função específica desta proteína permanece por esclarecer. Este trabalho tem como objectivo identificar polimorfismos no gene PRND em indivíduos do sexo masculino (humanos e ovinos) e comparar a qualidade e crioresistência dos seus espermatozóides com base nos diferentes polimorfismos encontrados (humano: codão 174 e 3’UTR; ovino: codão 26) através da análise da motilidade, vitalidade, concentração e morfologia de sémen fresco e submetido à criopreservação. O sémen ovino crio-preservado também foi avaliado quanto ao potencial mitocondrial transmembranar de espermatozóides pós-swim-up, quanto ao seu estadio de capacitação e quanto à sua capacidade de fertilização in vitro. A expressão de Doppel ovino em espermatozóides da raça Churra Galega Mirandesa também foi caracterizada e quantificada de acordo com o genótipo do codão 26 do gene PRND através de imunofluorescência indirecta e de citometria de fluxo, usando anticorpos monoclonais produzidos especificamente contra este péptido. Os resultados deste trabalho permitiram, pela primeira vez, detectar na população portuguesa três polimorfismos do gene PRND humano (dois polimorfismos no codão 174 e um 38 pares de bases 3’UTR), bem como o aumento da viabilidade do sémen após a descongelação em dadores com o genótipo CT do codão 174 (genótipo wildtype) associado ao genótipo TT do polimorfismo 3’UTR (genótipo wild-type) deste gene. Para além disto, é possível concluir que a presença do genótipo AA do codão 26 do gene PRND ovino melhora a crio-resistência do sémen e a produção de embriões. Em ovinos, estes resultados não só permitiram identificar a proteína Doppel em sémen fresco, através de imunofluorescência indirecta, como também permitiram a detectar, por citometria de fluxo, uma diminuição da expressão desta proteína em espermatozóides ovinos submetidos ao processo de criopreservação . Este trabalho permitiu ainda concluir que a identificação da proteína Doppel ovina em espermatozóides frescos, bem como a diminuição da sua expressão após o processo de criopreservação, revelam uma importante função fisiológica desta proteína na fertilidade masculina, abrindo novos horizontes na selecção de machos com melhor crio-resistência e capacidade reprodutiva, ou no desenvolvimento de tratamentos clínicos de infertilidade.The PRNP (prion protein gene) is responsible for the expression of the cellular prion protein (PrPC). After undergoing a post-translation conversion into an abnormal isoform, scrapie associated PrP (PrPSc) is involved in the transmission and pathogenesis of transmissible spongiform encephalopathies (TSE), including scrapie in sheep. More recently, Moore et al. (1999) discovered another gene whose locus is located downstream of that of the PRNP and named it PRND (prion-like protein gene). Also, PRND gene is thought to emerge from early gene duplication. This new gene is responsible for the expression of the downstream prion like protein, also known as Doppel or Dpl, which is not involved in prion propagation. Doppel is highly expressed in testis (Sertoli and germ cells), in the heart, in the ovaries (granulosa cells) and, unlike PrPC, is poorly expressed in the Central Nervous System. In PRND-knockout mice, females are fertile and viable, while males are infertile, suggesting a major role in male reproduction. Several studies have shown that the lack of Doppel can be associated with deficient acrosomic reaction and malformations on spermatozoa head and middle piece, impeding the spermatozoa to penetrate in the zona pellucida. Recent studies from our research group have demonstrated that capacitation medium supplemented with Doppel protein increases fertilization ability in sheep. Moreover, previous results showed an association between ram PRND gene polymorphisms and sperm fertilization ability and cryoresistance. However, the accurate physiological function of Doppel remains unclear. This work aimed to identify, characterize and quantify the expression of Doppel protein in ovine spermatozoa with different PRND polymorphisms by indirect immunofluorescence and flow cytometry. Moreover, the quality and cryoresistance of human and ovine sperm were compared based on different PRND polymorphisms, by analyzing the motility, vitality, concentration and morphology of fresh and thawed sperm. Ram semen was also evaluated by analyzing mitochondrial membrane potential of post-swim-up spermatozoa and by testing its in vitro fertilization ability. In conclusion, our results confirm that the AA genotype in codon 26 of ovine PRND gene is important for an improved semen cryoresistance and embryo production. Also, three human PRND polymorphisms were detected for the first time in male Portuguese population and an enhanced viability after thawing and centrifugation in density gradients of post-thawed sperm observed in male donors carrying CT genotype of codon 174 polymorphisms linked to TT genotype of 3’UTR of human PRND gene. Furthermore, the identification of Doppel protein in ovine semen and its decrease expression after the frozen-thawed process strongly suggests an important physiological function in male fertility