Detection of proteins involved in chromatin remodeling Of bovine embryos produced from oocytes derived from Small and large antral follicles

It has been demonstrated that oocytes of several species acquire the capacity to complete meiotic maturation and support early embryonic development during the final stages of follicular growth. Aiming to investigate molecular differences between bovine embryos produced from oocytes derived from small (1 to 2-mm) and large (4 to 8-mm) follicles, two experiments were designed to evaluate by immunocytochemistry the presence on chromatin of three regulatory factors involved mainly in DNA transcription and repair. In the first experiment, we evaluated whether the expression pattern of the High- Mobility Group N2 (HMGN2) and acetylated histone H3 Lysine 14 (Ac.H3K14) were affected by the origin (from small vs. large follicles) and time of first cleavage ( 24 h) of parthenogenetically activated (PA) oocytes. Early (until 24 hr) and late (after 24 hr) cleaved embryos were fixed at 36, 50, 60, 70 and 80 h after PA and processed to detect HMGN2 or Ac.H3K14. The rate of nuclear maturation (81% vs. 59%), early cleavage (47% vs. 39%), and blastocyst (34% vs. 19%) were significantly higher (P<0.05) in oocytes from large compared to small follicles. The rate of Ac.H3K14 (61% vs. 38%) and HMGN2 (74% vs. 56%) positively stained nuclei at 60 h post PA was higher (P<0.05) in embryos derived from small compared to large follicles. However, more HMGN2 positively stained nuclei (94% vs. 75%; P<0.05) were detected in embryos from large follicles at 80 h post PA. We concluded that the temporal proportion of embryonic nuclei with positive signal to HMGN2 and Ac.H3K14 is affected by both follicle size and time to complete first cleavage of oocytes. In the second experiment, we investigated whether the expression pattern of the phosphorylated histone H2A.X (γH2A.X) protein, which is an indicator of DNA double-strand breaks, is different in embryos produced from oocytes derived from small or large follicles. Oocytes were PA or in vitro fertilized (IVF) for 18 h and then cultured. Cleavage was assessed at 24 and 36 h after PA and at 32 and 42 h after IVF. Cleaved embryos were fixed at 36 h after PA and 42 h after IVF, and then processed to detect the γH2A.X. Most of the cleaved embryos produced from PA and IVF oocytes had detectable amounts of γH2A.X, ranging from few foci to a complete diffuse staining of the nuclei. γH2A.X was detected in 64% vs. 76% (P<0.05) of nuclei in PA embryos and in 76% vs. 80% (P>0.05) of nuclei in IVF embryos produced from oocytes derived from small and large follicles, respectively. IVF embryos presenting less than 4 nuclei at 42 h showed higher rates (P<0.05) of γH2A.X positive nuclei (89% and 85%) than those with ≥4 nuclei (72% and 62%, for large and small follicles, respectively). We found that γH2A.X is highly detected but not differently expressed in early bovine embryos produced from PA and IVF oocytes derived from small and large follicles. In general, the present experiments demonstrate that HMGN2, Ac.H3K14 and γH2A.X proteins are expressed during early bovine embryogenesis.Tem sido demonstrado que oócitos de várias espécies adquirem capacidade para completar a maturação meiótica e suportar o desenvolvimento embrionário durante os estágios finais do crescimento folicular. Com o objetivo de investigar diferenças moleculares entre embriões bovinos produzidos a partir de oócitos derivados de folículos pequenos (1-2 mm) e grandes (4-8 mm), dois experimentos foram delineados visando identificar por imunocitoquimica a presença de três fatores reguladores da cromatina envolvidos principalmente nos processos de transcrição e reparo do DNA. No primeiro experimento, foi investigado se o perfil de expressão das proteínas (do inglês) High-Mobility Group N2 (HMGN2) e histona H3 acetilada na lisina 14 (Ac.H3K14) seria alterado pela origem dos oócitos (folículos pequenos vs. folículos grandes) e pelo tempo necessário para realizar a primeira clivagem (24 h) após ativação partenogenética (AP). Embriões clivados cedo (até 24 h) e tarde (após 24 h) foram fixados às 36, 50, 60, 70 e 80 h após AP e processados para detectar a HMGN2 ou Ac.H3K14. Os percentuais de maturação nuclear (81% vs. 59%), clivagem cedo (47% vs. 39%) e blastocisto (34% vs. 19%) foram significativamente maiores (P<0,05) nos oócitos oriundos de folículos grandes em comparação aos de folículos pequenos. Os percentuais de núcleos positivos para Ac.H3K14 (61% vs. 38%) e HMGN2 (74% vs. 56%) às 60 h após AP foram maiores (P<0,05) nos embriões produzidos a partir de oócitos de folículos pequenos comparado aos de folículos grandes. Entretanto, um maior percentual de núcleos positivos para HMGN2 (94% vs. 75%; P<0,05) foi detectado em embriões produzidos com oócitos de folículos grandes às 80 h após a AP. Concluiu-se que a proporção de núcleos com sinal positivo para HMGN2 e Ac.H3K14 é dependente do tamanho dos folículos e do tempo transcorrido para os oócitos realizarem a primeira clivagem. No segundo experimento, foi investigado se o perfil de fosforilação da proteína histona H2A.X (γH2A.X), que é um indicador de rompimento da cadeia dupla do DNA, seria diferente em embriões produzidos a partir de oócitos oriundos de folículos pequenos ou grandes. Os oócitos foram submetidos à AP ou fertilização in vitro (FIV) por 18 h e, então, cultivados. A clivagem foi avaliada 24 e 36 h após a AP e 32 e 42 h após FIV. Os embriões clivados foram fixados 36 h após AP e 42 h após FIV, e então processados para detectar a presença da γH2A.X. A maioria dos embriões produzidos a partir de oócitos submetidos à AP e FIV apresentou quantidades detectáveis de γH2A.X, variando entre poucos focos até um sinal completamente difuso no núcleo. A γH2A.X foi detectada em 64% vs. 76% (P<0,05) dos núcleos dos embriões ativados e em 76% vs. 80% (P<0,05) dos núcleos dos embriões de FIV produzidos a partir de oócitos oriundos de folículos pequenos e grandes, respectivamente. Embriões oriundos de FIV que apresentaram número <4 núcleos às 42 h tiveram maiores percentuais (P