Experimental analysis of biaxial mechanical tension in cell monolayers and cultured three-dimensional tissues: the CellDrum technology

Kurzfassung Die biomechanische Integrität und Leistungsfähigkeit von Gewebe und Organen beeinflusst die Gesundheit des Menschen in extremer Weise. Weitverbreitete Erkrankungen wie Hernienbildung (Eingeweidebruch) und Beckenbodendefekte (jährlich alleine zehn Million Patientinnen in den USA) stehen mit einer verminderten biomechanischen Gewebefunktionalität in einem klaren Zusammenhang. Diese exemplarisch genannten Erkrankungen, aber auch Dysfunktionen des Herz-Kreislaufsystems sind auf biomechanische Veränderungen auf zellulärer Ebene zurückzuführen. Grundlagenforschung hierzu am Menschen ist aus ethischen und praktischen Gründen, insbesondere bei der Erprobung aktiver Substanzen problematisch. In der Literatur werden zur Evaluierung biologischer Materialeigenschaften in vitro Testsysteme vorgeschlagen, welche relativ unkritisch aus Methoden der konventionellen Materialprüfung abgeleitet worden sind. Dies betrifft insbesondere einachsiale Zugversuche. Die meisten Spannungssituationen in biologischen Systemen sind aber dreiachsial oder zweiachsial. Der einachsiale Spannungszustand tritt allenfalls in dünnen Sehnenstrukturen auf. In dieser Arbeit wurde ein Messprinzip entwickelt, welches es erlaubt, Zellmonolayer und dünne Gewebeschichten unter biaxialer Belastung zu züchten und mechanisch zu analysieren.Ein grundlegender Bestandteil des Messverfahrens ist, das CellDrum genannte, Zellkultivierungsmodul. Die entwickelte CellDrum besteht aus einem biokompatiblen, Polycarbonatzylinder, welcher mit einer ebenfalls biokompatiblen, dünnen (< 1 mikron) und extrem flexiblen Siliconmembran einseitig verschlossen ist. Die Silikonmembran kann einerseits mit Zellmonolayern besiedelt werden oder dient als Halte- und Unterstützungschicht bei der Kultivierung von auf Zell-Kollagengel basierenden Gewebeäquivalenten. Die CellDrum Technologie ist universell verwendbar für beinahe jede Art der Materialprüfung dünner Schichten. Untersuchungen können prinzipiell dynamisch und quasistatisch durchgeführt werden. Im dynamischen Ansatz wird die Resonanzfrequenz und somit die Eigenspannung des Gewebeverbundes analysiert, welcher durch einen Druckimpuls zum Schwingen angeregt wird. Der quasistatische Ansatz ermöglicht die Untersuchung des Spannungs-Dehnungsverhaltens der Testmaterialien (in dieser Arbeit: Zellmonolayer und Gewebeäquivalente). Den verschiedenen Fragestellungen und Testsituationen angepasst, wurden Technologien entwickelt, die von der Herstellung flexibler, biokompatibler Membranen mit Dicken im Mikrometerbereich über Hard- und Softwarelösungen bis hin zur biomechanischen Problemanalyse zur Ableitung geeigneter biomechanischer Parameter reichten. Es war diese extreme Interdisziplinarität zwischen Zell- und Molekularbiologie, Polymerchemie, Mechanik und anderen Ingenieurwissenschaften, die gleichermaßen gut beherrscht werden mussten, was die Herausforderung dieser Arbeit darstellte. Zellbasierte Systeme reagieren hinsichtlich Orientierung, Morphologie, Stoffwechsel sowie Protein- und Genexpression auf Veränderungen ihrer mechanischen Umgebung. Diese Problematik wurde bei der CellDrumkonzeption bedacht, experimentell evaluiert sowie technisch und theoretisch realisiert. Neben den zuvor genannten Problemlösungen mussten Tests zur Eignung verschiedener Adhäsionsproteine durchgeführt werden. Ungeeignete Proteine zeigten im statischen Spannungszustand biokompatibles Verhalten; bei dynamischer Belastung initiierten dieselben Proteine ein Zellsterben. Ein anderes, nicht kleines Problem war die Verankerung des Randes der künstlichen Gewebeschicht an der Peripherie. Das Zusammenspiel zwischen Gewebespannung, Zellproliferation und Zellkonzentration wurde in der Vergangenheit mit verschiedenen Verfahren experimentell analysiert. Die Neuheit des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens besteht darin, die Zellverbände über lange Zeiten (Wochen) statisch oder dynamisch unter genau definierten mechanischen Randbedingungen kultivieren zu können und gleichzeitig die Möglichkeit zu haben, den mechanischen Spannungszustand des gezüchteten Konstruktes zu beliebigen Zeiten zu messen. Es wurde hier der Zusammenhang zwischen Gewebespannung und Zellproliferation für mit Fibroblasten besiedelte Gewebeäquivalente exemplarisch dargestellt. Die gewonnenen Erkenntnisse, insbesondere Plateaueffekte bei der Gewebespannungsgeneration, lassen aufschlussreiche Rückschlüsse auf die Spannungshomeostase im Gewebe zu. Die Stimulierung von Gewebeäquivalenten durch Wirkstoffe und die Variation von Prozessparameteren während der Zellkultivierung bestimmen Eigenspannung und E-Modul des Messobjektes mit. Durch die Anpassung bestehender Verfahren der Mikrosystemtechnik konnte ein Verfahren in die biologische Materialprüfung transferiert werden. Dieses quasistatische Verfahren ermöglicht die Messung von Gewebeeigenspannung und E-Modul in nur einem Messdurchlauf.Die Zellaktivität (Morphologie, Metabolik, Protein- und Genexpression) wird durch ihr mechanisches Umfeld determiniert. Viele in der Literatur beschriebene Messverfahren induzieren ein inhomogenes Spannungsfeld mit van Mieses Vergleichsspannungen, die im selben Gewebekonstrukt um mehr als 75% variieren. Die kreisrunde Geometrie der CellDrum erlaubt ein weitestgehend homogenes Spannungsfeld. Zur Untersuchung von autolog und synchron schlagenden Kardiomyozyten (Herzmuskelzellen) wurden geeignete Zellkulturtechniken entwickelt, um diese als Monolayer oder Gewebeäquivalente mit der CellDrum Technik untersuchen zu können. Es wurde eine Methode entwickelt, um primäre Kardiomyozyten aus zehn Tage alten Embryos angebrüteter Hühnereier zu gewinnen. Die Methode wurde später mit einem Partner auf neonatale Rattenmyocyten transferiert.Zur Entwicklung, Optimierung und Standardisierung zellbiologischer Messprotokolle ist insbesondere die Möglichkeit einer optischen Überwachung während der Kultivierungsphase von großer Bedeutung. Die Möglichkeit der kontinuierlichen mikroskopischen Evaluierung, bei gleichzeitig minimaler Störung der Messumgebung ist einmalig und in der beschriebenen Apparatur gewährleistet. In allen Anwendungen ist für die Interpretation von Meßdaten auch die Zelldichte ein entscheidender Parameter. In Verbindung mit einem invertierten konfokalen Lasermikroskop können Zelldichte und Orientierung während der Kultivierungsperiode ermittelt werden. Neben der weitgehend unbefriedigenden biomechanischen Situation früherer Methoden, war oft auch die Versuchsdurchführung kritisch, kompliziert und fehlerbehaftet. Zum Sekundärscreening potentieller therapeutischer Wirksubstanzen müssen zehntausende Substanzen funktionell getestet werden. Das CellDrum-Verfahren liefert als bisher einzige Technik die Grundlage für ein automatisierbares Hochdurchsatz-Screening-Konzept. Dies wurde an Fibroblasten-Kollagen Verbunden exemplarisch gezeigt.A person’s health is determined by the biomechanical integrity and performance of tissue and organs. Widespread diseases like hernia formation or pelvic floor malfunction are directly related to a reduced biomechanical functionality of the concerned soft tissue. These exemplary diseases, but also dysfunction of the cardiovascular system are caused by processes, which are based on changes of biomechanical properties at the cellular level. Fundamental research in this topic on humans is limited for practical and ethical reasons, especially the evaluation of active substances. The systems for the in vitro evaluation of biomechanical material properties, as described in the literature, are adopted from standard material test methods mainly focusing on an uniaxial loading. But uniaxial loading is rarely seen in nature since most load cases are two or three dimensional. This work describes a new measurement principle, which allows the cultivation of cell monolayers or thin tissue composites under biaxial load conditions and mechanical evaluation at the same time. A new cell cultivation module, termed CellDrum, was developed for that purpose. The Celldrum consists of a thin, biocompatible silicon membrane attached to a cylindrical well . The CellDrum membrane can be populated with cells grown in monolayer structures or serves as a sealing boundary layer for thin film cell-matrix constructs anchored with the Cell Drum’s wall. The CellDrum technology is a universal approach and can be used for almost any kind of material test on thin films. Investigations can be performed either under a dynamic or quasi-statical mode. Mechanical properties of cell populated CellDrum constructs were analyzed in the dynamic setup, after excitation via a pressure impulse and measuring the resonance frequency of vibrating tissue constructs anchored to the CellDrum. The quasi-statical mode allows evaluating the stress-strain behavior of test material (in this work: cell monolayer and thin tissue equivalents). Technologies were developed, adapted to the specific questions and experimental needs, ranging from flexible, µm-thin, biocompatible membranes over hard- and software solutions up to the biomechanical analyses for the extraction of adequate biomechanical parameters. This interdisciplinary effort between cell- and molecular biology, polymer chemistry, mechanics and other engineering fields, which had to be controlled in equal measure, was the major challenge of this work.Optical monitoring during cell cultivation is vitally important for the development, standardization and optimization of cell-biological measurement protocols. The possibility of a continuous microscopic evaluation of the test specimen, at a minimal disturbance of the measurement environment, is a unique feature of the described apparatus. In combination with confocal laser microscopy it is also possible to identify cell density and orientation during the cultivation period. These values are important parameters for the correct interpretation of the derived measurement data.Cell based systems can sense changes in their mechanical environment and promote alterations and adaptations in tissue structure and function, like metabolism, orientation, protein and gene expression. These factors were considered for the CellDrum development and carefully evaluated by accompanying experiments. The use of circular CellDrum constructs introduces a homogenous stress distribution within the sample construct, similar to the biaxial state found in most in vivo situations for soft tissues. The CellDrum system therefore supports a cell proliferation with random cell orientation in contrast to the initiation of parallel cell orientation found in common approaches with rectangular stretched cell seeded collagen cells. Furthermore, finite element method investigations proved the homogenous stress distribution for the circular CellDrum, compared to the strong variations of the van Mieses equivalent stress values in a rectangular stretched gel. Besides mentioned circumstances, further experiments had to be performed to evaluate the contributions of different membrane coatings on the cellular response to substrate strain variations. The cells reacted differently to the employed coating under strained and unstrained conditions. The measurement system described in this work offers the opportunity to analyze the mechanical properties of cell constructs over a long period of time (weeks) under defined mechanical boundary conditions either in the dynamic or statistical setup. The relation between cell proliferation and residual tissue stress was exemplarily demonstrated. The studied cellular response, especially the plateau effect during the generation of tissue tension, provides further conclusions about mechanical homeostasis of soft tissue. The understanding of these phenomena may contribute to the understanding of the mechanics of wound healing and of scar formation. The stimulation of tissue equivalents during cell cultivation and the variation of process parameters had a direct impact on the E-module and residual tension of the evaluated specimen. Both parameters were analyzed synchronously by the transfer and adequate adaptation of an analyzing method, which was originally developed for microsytem technologies. Furthermore, described system is the first system which offers the novel and unique possibility to cultivate synchronously beating cardiomyocytes and evaluate the contractile behaviour together with the monitored beating frequency. A specific method was developed to obtain primary cardiomyocytes from 10 day old chicken embryos and later on transferred by a research partner on neonatal rat myocytes. Complicated and error-prone experimental handling was a major concern in earlier methods, besides the unsatisfying situation of undefined mechanical boundary conditions. During pharmaceutical research activities, thousands of substances have to be evaluated for potential pharmaceutically efficacy by secondary screening. Unlike most devices introduced before, the system established here can easily be scaled up towards a high-throughput system providing simultaneous material data on large numbers of tissue constructs exposed to various chemical agents. This was exemplarily demonstrated for fibroblast-collagen composites