Entwicklung eines automatisierten Biomechatronik-Robotik-Systems (MyoRobot)

Research in biomechanics on, e.g., muscle fibers, bio-tissues or bio-molecular polymers, often drives the experimenter to her / his limits due the involvement of critical time handling and tedious manual systems operations. Therefore, comprehensive studies, particularly in single fiber or multicellular skeletal muscle tissue components, are rare and susceptible to manually induced biases. This fact often limits the translation of biochemical to biomechanical knowledge in tissue- and material-based research. Although the number of commercially available biomechatronics systems increases, they are often restricted in their application or operation due to a missing ’point-of-care’ approach. Thus, we sought to conceptualize and engineer a device that overcomes the experimentation difficulties of manually driven systems and ensures the flexibility of application and user-designed biomechanics recording protocols. To accomplish this task, the 1st version of our MyoRobot was validated for automated execution of recording protocols for e.g. myofibrillar biosensor Ca2+ sensitivity, speed of shortening and (visco-)elasticity to name a few. This system was tested in an exhaustive age- and genotype-dependent study of active and passive biomechanics of the murine DesR349P analogous of the most common form of inherited human DesR350P desminopathy, a disorder of structural cytoskeletal protein components. The hallmark of desminopathies is reflected by an aggregation of mutant desmin and enhanced passive elasticity / stiffness in mutated skeletal muscle fibers, which was successfully reproduced here and supported the hypothesis of a pre-aged phenotype of affected muscle tissue from direct single- / multicellular automated biomechanics recordings, for the first time. Intriguingly, axial stiffening did not affect shortening kinetics or active contraction in general. Here, age-related effects, such as a biosensor Ca2+ sensitization in samples from older animals, were more pronounced than those caused by presence of either one or two mutated desmin alleles. Overall, our results largely aligned with and substantially expanded existing literature and confirmed automated protocol execution and data acquisition / analysis with our MyoRobot 1.0 as valuable new biomechatronics approach. The initial step validated the system for repeated and reliable assessment of biomechanics properties and rendered it superior to existing manual systems. By engineering an optical imaging system into our biomechatronics platform, becoming independent from external commercial microscopes, force normalization to cross-sectional area was also enabled. In a study investigating the R577X α-actinin 3 null polymorphism, the inbuilt optics endorsed as a resourceful advancement for comparing results across macro (whole muscle) to micro (single cell) scales in our MyoRobot 1.5. The α-actinin 3 null polymorphism reflects a genetic mutation in fast skeletal muscle and is evolutionary favoured by positive selection in humans. It predisposes approximately 17% of mankind to endurance exercise, while penalizing strength / sprint performance on the other hand and thus, has been termed ’gene-of-speed’. Concurringly, we observed a trend to reduced maximum forces in knock-out fibers, which however, was revoked after cross-section-normalization, suggesting a smaller diameter in knock-out fibers but no compromised ’quality-of-force-production’ beyond smaller cross-sectional area of single fibers, as reported in literature. Consistent with a proposed shift of fast-twitch fibers to a more oxidative metabolism and slow-twitch fiber characteristics, the null polymorphism was more resistant to contraction-induced injury. Furthermore, axial elasticity and shortening kinetics were unaltered. Within that course, the standard but tedious mechanical bio-separation technique to obtain functional single muscle fibers was opposed to a new straight-forward bio-active enzymatic digestion process. Here, the mechanical approach was ultimately preferred over the more easy-to-use chemical bio-separation for reasons of robustness and reliability. To complete the engineering expansion to the MyoRobot 2.0, environmental temperature and sarcomere length control were implemented and further expanded its range of application. Adjusting sarcomere length to predefined regions where, e.g., restoration force is predominantly determined by passive elements or standardized resting sarcomere length, greatly increased reliability of biomechanics results. The enhanced system allows to design and customize a wealth of experimental recordings to determine active and passive biomechanics properties, such as temperature-dependent muscle performance, stress-strain relationships and elasticity moduli. The presented work describes the engineering and validation of successive improvements of the MyoRobot (excluding the temperature-controlled rack). Stress-strain recordings at 2.6 μm resting sarcomere length revealed an increased axial compliance with strain and Young’s moduli ranging from 40 - 60 kPa, which is compatible with physiological ranges given in literature. In conclusion, the automated MyoRobot 2.0 was shown to be a versatile and reliable stand-alone platform that covers almost every aspect of modern biomechanics in biomedical research. Moreover, it addresses the future problem of personalized medicine to conduct reliable tissue / (bio)material testing on a rising numbers of synthetically / biologically engineered transplants prior to implantation. Due to its vast applicability to biomedical sciences, the MyoRobot 2.0 is highly attractive for an upcoming market introduction and reflects a worthy competition to existing commercial systems.Forschung im Bereich der Biomechanik an bspw. Muskelfasern, biologischem Gewebe oder bio-molekularen Polymeren stellt Wissenschaftler oftmals vor eine große Herausforderung aufgrund von präziser Zeiteinhaltung und Gebundenheit an mühsam zu bedienende manuelle Messsysteme. Deshalb sind umfassende Studien zu einzelnen Muskelfasern oder zu multizellulärem Muskelgewebe nur rudimentär vorhanden und stets anfällig für menschlich induzierte Fehlerquellen. Dies führt oft dazu, dass die Auswirkungen biochemische Befunde in Gewebs- oder Materialwissenschaften nicht auf einer biomechanischen Ebene erklärt werden können. Obwohl die Anzahl der auf dem Markt verfügbaren biomechatronischen Messsystemen allmählich zunimmt, sind diese meist in ihrer Anwendung und Vielseitigkeit aufgrund eines fehlenden ’patientennahen’ Diagnostikansatzes limitiert. Aus diesem Grund ersuchten wir die Konzeption und den Bau eines Geräts, das einerseits die experimentellen Hürden manueller Messsysteme überwindet und andererseits Flexibilität in Anwendungsbereichen, sowie die benutzerdefinierte Erstellung biomechanischer Messprotokolle gewährleistet. Um dies zu ermöglichen wurde die erste Version unseres MyoRobot 1.0 zunächst auf automatisierte Messprotokollausführung getestet um bspw. die Ca2+ Sensitivität des myofibrillären Biosensors, Kontraktionsgeschwindigkeit oder (Visko-)elastizität in Messungen zu bestimmen. Hierzu wurde unser MyoRobot 1.0 in einer umfassenden, Alters- und Genotyp-übergreifenden Studie zur Messung aktiver und passiver biomechanischer Parameter im murinen DesR349P Modell getestet. Das Modell entspricht dem Analogon der am weitest verbreiteten Form menschlich vererbbarer DesR350P Desminopathie, die zu einer strukturellen Störung innerhalb der Proteinkomponenten des Zytoskeletts führt. Typisch für Desminopathien ist die Aggregatbildung von mutiertem Desmin und eine erhöhte passive Steifigkeit / Elastizität in mutierten Muskelfasern, was sich in dieser automatisierten Biomechanik-Studie erfolgreich reproduzieren liess und die Hypothese einer verfrühten phänotypischen Ausprägung im betroffenen Muskelgewebe erstmalig unterstützt. Interessanterweise führte die erhöhte axiale Steifigkeit zu keinen grundlegenden Änderungen der Kontraktionskinetik oder aktiven Kontraktilität. Dafür waren hier altersabhängige Effekte bezüglich Ca2+-Sensitivierung des Ca2+ Biosensors oder aktiven Muskelkontraktion deutlicher bemerkbar. Im Großen und Ganzen stimmten unsere Ergebnisse mit bereits existierender Literatur überein und erweiterten diese um wesentliche Erkenntnisse. Darüber hinaus wurde die automatisierte Messprotokollausführung und Datenakquise mit unserem MyoRobot 1.0 als verlässliche Methodik etabliert, welche unsere automatisierte biomechatronische Messplattform bereits bestehenden manuelle Systemen überlegen macht. Durch die Integration optischer Bildgebung in unserem MyoRobot 1.5 wurde dieser unabhängig von externen Forschungsmikroskopen und ermöglicht eine Kraftnormalisierung auf den Präparationsquerschnitt. In einer Studie über den R557X α-actinin 3 Null-Polymorphismus bewies sich die integrierte Optik als wertvolle Erweiterung um Ergebnisse von makroskopischen (ganzer Muskel) bis hin zu mikroskopischen (einzelne Muskelfaser) Skalen in unserem MyoRobot 1.5 zu vergleichen. Der α-actinin 3 Null-Polymorphismus ist eine genetische Mutation in ’schnell zuckenden’ Muskelfasern und ist evolutionär durch positive Selektion begünstigt. In den betroffenen 17% der Weltbevölkerung führt er zu einer Prädisposition für Ausdauertraining, wohingegen er sich negativ auf Kraft- oder Sprintleistung auswirkt. Daher wurde das betroffene Gen auch ’Gen für Geschwindigkeit’ benannt. Dementsprechend stellten wir eine Tendenz für abgeschwächte Maximalkraft in knock-out Einzelfasern fest, welche jedoch nach Querschnittsnormalisierung verschwand und somit auf einen geringeren Faserdurchmesser in knock-out Fasern deutete. Trotz des geringeren Durchmessers generierten knock-out Einzelfasern qualitativ adäquate Kräfte, wie auch in der Literatur berichtet. Passend zum beschriebenen Wechsel von ’schnell zuckenden’ Muskelfasern zu einem oxidativen Metabolismus und Angleichung an ’langsam zuckenden’ Muskelfasern beobachteten wir, dass α-actinin 3 knock-out Proben deutlich resistenter gegenüber zuginduzierten Verletzungen waren. Darüber hinaus waren axiale Elastizität und Kontraktionskinetik unverändert. Im Zuge der Studie wurde ebenso der standardmäßige, jedoch arbeitsintensive mechanische Ansatz zur Bioseparation von funktionellen Einzelmuskelfasern mit einem neuen, vereinfachten Enzymverdau verglichen. Hier wurde der mechanische Trenntechnik-Ansatz schlussendlich aufgrund seiner Robustheit und Verlässlichkeit vorgezogen. Um die bautechnische Weiterentwicklung zum MyoRobot 2.0 zu vervollständigen, wurde das System um Kontrolle der Umgebungstemperatur, sowie der Sarkomerlänge erweitert. Die Möglichkeit, die Sarkomerlänge an Bereiche anzugleichen, in denen bspw. vornehmlich passive Elemente die Rückstellkräfte beeinflussen, stellt eine große Verbesserung der Vergleichbarkeit von biomechanischen Ergebnissen dar. Das verbesserte System ermöglicht dem Benutzer eine Großzahl an experimentellen Protokollen nach Bedarf anzupassen, um sowohl aktive als auch passive biomechanische Eigenschaften von Muskelgewebe, wie bspw. die temperaturabhängige Leistung, Spannungs-Dehnungskurven und Elastizitätsmodule zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit beschreibt den Bau und die Validierung der sequenziellen Verbesserungen des MyoRobot (exklusive Temperaturkontrolle). Spannungs-Dehnungskurven, die bei definierten 2.6 μm Ruhe-Sarkomerlänge starteten, zeigten einen Zunahme der ’Compliance’ mit ansteigender Elongation und Elastizitätsmodulen zwischen 40 - 60 kPa, welche gut mit dem in der Literatur berichteten physiologischen Bereich übereinstimmten. Zusammenfassend hat sich der automatisierte MyoRobot 2.0 als versatiles und verlässliches Messsystem bewiesen, welches fast jeden Aspekt der modernen biomechanischen Forschung in der Biomedizin und den Biomaterialien abdeckt. Darüber hinaus adressiert das System ein zukünftiges Problem der personalisierten Medizin, in der eine steigende Anzahl von synthetische / biologisch gefertigten Transplantaten vor der Implantation verlässlichen Gewebs- bzw. (Bio)materialtests unterzogen werden müssen. Basierend auf seiner vielseitigen Einsetzbarkeit für die biomedizinische Forschung wird der MyoRobot 2.0 als vielverprechend für eine zukünftige Markteinführung angesehen und wird eine starke Konkurrenz zu bereits bestehenden, kommerziellen Systemen darstellen