Επίδραση υπερενυδάτωσης των αθλητών στη φαρμακοκινητική απαγορευμένων ουσιών στον έλεγχο αντι - ντόπινγκ

Doping is a multifaceted phenomenon, officially defined as the occurrence of one or more of the antidoping rule violations as stated in the World Anti-Doping Code: the presence of a prohibited substance (or its metabolites), the misuse or attempted use or possession or trafficking of a prohibited substance or method, the refusal or failure for testing, the (attempted) administration to any athlete of any prohibited method or substance and tampering or any attempt to tamper collected samples are all considered as doping offences.Excessive fluid intake, i.e., hyperhydration is not prohibited as a practice according to the World Anti-Doping Agency`s (WADA) current regulations. However, hyperhydration may be adopted by athletes as a masking method during anti-doping sample collection to influence the excretion patterns of doping agents and, therefore, manipulate their detection. The aim of the present study was to evaluate the role of hyperhydration as a potential doping masking method, by assessing the effect of excessive fluid ingestion on the urinary steroidal and haematological Athlete Biological Passport (ABP), on the urinary endogenous luteinizing hormone (LH) excretion patterns and on the blood (plasma/serum) and urinary pharmacokinetic (PK) characteristics and detection of two representative prohibited substances, namely, Epoetin beta (rHuEPO) and budesonide (BDS) after a single subcutaneous and oral dose administration, respectively. The presentation of the study results is structured into three Parts (A-C). In the first part, “Part A: Introduction & Study design”, the rational of the study and a description of the study protocol and methodology is given together with the study aim and objectives, as “Chapter 1: Introduction” and “Chapter 2: Study design and methodology”. The full study protocol, as reviewed by the Health, Medical and Research Committee of WADA (10D21CG) and approved by the Ethics Committee of the Anti-Doping Lab Qatar, Doha, Qatar (F2013000006) is presented in Annex C. In brief, seven healthy, Caucasian, recreationally active non-smoking male volunteers were enrolled in the study and participated in all the study phases. The study comprised the following phases: a baseline phase, i.e., no drug administration, with and without hyperhydration and two drug phases, i.e., drug administration, with and without hyperhydration. The aim of the baseline phase was to examine the hyperhydration effect on the blood and urinary profiles of endogenous substances, i.e., endogenous anabolic androgenic steroids, endogenous erythropoietin, endogenous luteinizing hormone and on the haemodynamic markers included in the ABP. The aim of the drug phase was to perform a PK study of the selected doping substances, i.e., rHuEPO and BDS, administered as a single dose, in order to examine the hyperhydration effect on the serum and urinary concentration-time profiles and subsequent detection of each substance during doping control analysis. Hyperhydration was induced by either water or a commercial sports drink within 30 minutes by the ingestion of a bolus of 20 mL hyperhydration agent/kg body weight (i.e., 1400 mL for a 70-kg male). The collection and storage of urine and blood samples were performed according to the WADA`s official guidelines, following the sampling schedule described in the study protocol. All the serum and urine sample analysis were performed by validated analytical methods according to the WADA`s official guidelines and technical documents. Statistical data analysis was performed by SPSS version 25.0 (IBM SPSS Statistics for Windows, Version 25.0, IBM Corporation, Armonk, NY, USA) software package. Phoenix® version 8.0 PK/PD software package (Certara, Princeton, NJ, USA) was used for the PK data analysis. Non-compartmental analysis (NCA) was performed in all the cases while PK modeling was performed for rHuEPO.The second and third part of the study presentation (Parts B & C) are structured into chapters and each chapter is organized to be read independently. More specifically:“Part B: The effect of athletes` hyperhydration on haematological parameters and urinary profiles of endogenous biomarkers in doping control analysis”, consists of three chapters describing the effect of hyperhydration on the haematological parameters of the ABP (Chapter 3), on the urinary “steroid profile” markers (Chapter 4) and on the urinary endogenous LH concentrations (Chapter 5), respectively, as follows:Chapter 3: Effect of hyperhydration on the haematological parameters of the Athlete Biological Passport in doping control analysisABP is an indirect approach, implemented by WADA, aimed at detecting blood manipulation based on abnormal changes in haematological markers. Cases report the use of hyperhydration by athletes as a masking method during anti-doping urine sample collection which could also potentially mask suspicious fluctuations on ABP profiles. This study investigated the hyperhydration effect of different agents on the ABP haematological markers, i.e., haemoglobin concentration, reticulocyte percentage and calculated OFF-hr score, with and without rHuEPO administration. Seven healthy, physically active volunteers were recruited for a five-week period; Baseline Phase (Weeks 1 to 2) and rHuEPO Phase (Weeks 3 to 5). Water and a commercial sports drink were used as hyperhydration agents at a volume of 20 mL/kg body weight. According to the study protocol, to examine the hyperhydration effect on the normal ABP profile of each volunteer, only hyperhydration was implemented at 0, 24 and 48 hours during the baseline phase by either water or sports drink. During the rHuEPO phase, volunteers received a single 3000 IU dose of Epoetin beta with hyperhydration to be implemented at 0, 24 and 48 hours after drug administration. Blood and urine samples were collected and analyzed according to the WADA guidelines and technical documents. No significant effect (P > 0.05, 95% CI) on ABP markers was observed due to hyperhydration at any time during the study. Pre- and post-hyperhydration data were not significant different independently of the hyperhydration agent compared to individual baseline data with and without EPO administration. In conclusion, hyperhydration does not affect ABP haematological markers.Chapter 4: Effect of hyperhydration on the urinary ‘steroid profile’ markers in doping control analysisThe urinary ‘steroid profile’ in doping control analysis is a powerful tool aimed at detecting intra-individual deviations related to the abuse of endogenous steroids. Factors altering the steroid profile include, among others, the excessive fluid intake leading to low endogenous steroids concentrations compared to an individual`s normal values. Cases report the use of hyperhydration by athletes as a masking method during anti-doping urine sample collection. The seven healthy physically active non-smoking Caucasian males were examined for a 72-hour period using water and a commercial sports drink as hyperhydration agents (20 mL/kg body weight). Urine samples were collected and analyzed according to WADA`s technical documents. Although, significant differences were observed on the endogenous steroid concentrations under the studied hyperhydration conditions, SG-adjustment based on a reference value of 1.020 can eliminate the dilution induced effect. Adjustment methods based on creatinine and urinary flow rate were also examined, however, SG was the optimum method in terms of effectiveness to adjust concentrations close to the baseline steroid profile and practicability. No significant effect on the urinary steroid ratios was observed with variability values within 30% of the mean for the majority of data. Furthermore, no masking on the detection ability of endogenous steroids was observed due to hyperhydration. It can be concluded that any deviation on the endogenous steroid concentrations due to excessive fluid intake can be compensated by the SG-adjustment and, therefore, hyperhydration is not effective as a masking method on the detection of the abuse of endogenous steroids.Chapter 5: Effect of hyperhydration on the urinary luteinizing hormone concentrations in doping control analysisLow urinary LH values have been discussed as a marker to detect steroid abuse. However, suppressed LH concentrations related to highly diluted urine samples could be a misleading indication of anabolic steroid abuse. One aim of the present study was to examine the effect of hyperhydration on the interpretation of LH findings during doping control analysis and to investigate different possibilities to correct volume related changes in urinary LH concentrations. The seven healthy physically active non-smoking Caucasian males were examined for a 72-hour period using water and a commercial sports drink as hyperhydration agents (20 mL/kg body weight). Urine samples were collected and analyzed according to WADA`s technical documents. Baseline urinary LH concentrations for each individual were within the acceptable physiological range (7.11 ± 5.42 IU/L). Comparison of the measured LH values for both hyperhydration phases (Phase A: 4.24 ± 5.60 IU/L, Phase B: 4.74 ± 4.72 IU/L) with the baseline (‘normal’) values showed significant differences (Phase A: P 0.05, 95% CI) on serum or urinary EPO concentrations under hyperhydration conditions. No significant differences (P > 0.05, 95% CI) due to hyperhydration for any of the serum PK parameters were also observed. Renal excretion of endogenous and rHuEPO, as reflected on the urinary cumulative amount, was increased approximately twice after hyperhydration and this supports the non-significant difference on the urinary concentrations. Analysis of serum and urine samples was able to detect rHuEPO up to 72 hours after drug administration. The detection window of rHuEPO remained unaffected after water or sports drink ingestion. Hyperhydration had no effect on the detection sensitivity of EPO either in serum or urine samples. Chapter 7: Effect of hyperhydration on the detection sensitivity and pharmacokinetic parameters of BDS and its metabolites in urine and plasma doping control analysisThe aim of the present study was to investigate if hyperhydration could influence the excretion and subsequent detection of BDS and its main metabolites (6β-hydroxy-budesonide and 16α-hydroxy-prednisolone) during doping control analysis by leading to concentrations below the WADA reporting level (30 ng/mL). The influence of hyperhydration on the plasma and urinary PK profiles of BDS and metabolites was also examined. The seven healthy physically active non-smoking Caucasian males were participated in a 15-day clinical study. BDS was administered orally at a single dose of 9 mg on Days 1, 7 and 13. Hyperhydration was applied in the morning on two consecutive days, i.e., 0 and 24 hours after first fluid ingestion. Water and a commercial sports drink were used as hyperhydration agents (20 mL/kg body weight). Results showed no significant difference (P > 0.05, 95% CI) on plasma or urinary PK parameters under hyperhydration conditions for all the analytes. However, significant differences (P < 0.05, 95% CI) due to hyperhydration were observed on the urinary concentrations of BDS and metabolites. To compensate the dilution effect due to hyperhydration, different adjustment methods were applied based on specific gravity, urinary flow rate and creatinine. All the applied methods were able to adjust the concentration values close to the baseline ones for each analyte, however, specific gravity was the optimum method in terms of effectiveness and practicability. Furthermore, no masking on the detection sensitivity of BDS and its metabolites was observed due to hyperhydration either in plasma or urine samples. In conclusion, the present study revealed a clear effect of hyperhydration on the urinary profiles of endogenous biomarkers under the applied experimental conditions. However, concentration adjustment according to the WADA official SG-adjustment method proved to adequately compensate the dilution effect, while the dilution did not affect the detection sensitivity of the applied analytical methods. Based on the results of the present study, SG-adjustment of urinary concentrations of the studied biomarkers independent of the initial SG of the urine sample could be useful. No hyperhydration effect was observed on either serum or urine EPO concentration-time profiles or the reliability, robustness and detection sensitivity of the routine anti-doping analysis of rHuEPO. On the contrary, urinary concentrations of BDS and its metabolites namely, 6OH-BDS and 16OH-PREDN, were affected due to dilution after hyperhydration leading to increased percentage of samples below the reporting level (MRPL) of 30 ng/mL. Nevertheless, the WADA official SG-adjustment method was able to compensate the dilution effect by adjusting the concentration values closed to the baseline and, therefore, decreasing the percentage of samples below the MRPL.Despite the small number of volunteers enrolled, the results of the study are quite clear and promising regarding the effect of hyperhydration on the urine profiles of endogenous biomarkers, as well as on the serum/plasma and urinary profiles of exogenously administered prohibited doping substances as per WADA`s regulations. However, to explore the results of the present study and to further investigate their applicability for doping control purposes, multiple dose administration of the WADA prohibited substances, as well as different scenarios of hyperhydration implementation (e.g., twice a day), would be interesting.Το ντόπινγκ είναι ένα πολύπλευρο φαινόμενο, που ορίζεται επίσημα ως η εμφάνιση μιας ή περισσοτέρων παραβιάσεων σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Κώδικα Αντι-Ντόπινγκ. Η παρουσία απαγορευμένης ουσίας (ή των μεταβολιτών της), η κατάχρηση ή η απόπειρα χρήσης ή κατοχής, η άρνηση ή η αποτυχία ενός ελέγχου ντόπινγκ, η (απόπειρα) χορήγησης σε οποιονδήποτε αθλητή οποιασδήποτε απαγορευμένης μεθόδου ή ουσίας και η αλλαγή ή οποιαδήποτε προσπάθεια αλλαγής των συλλεχθέντων δειγμάτων θεωρούνται όλα ως αδικήματα ντόπινγκ.Η υπερβολική πρόσληψη υγρών (υπερενυδάτωση), δεν απαγορεύεται ως πρακτική σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς του Παγκόσμιου Οργανισμού Αντι-Nτόπινγκ (World Anti-Doping Agency). Εντούτοις, η υπερενυδάτωση μπορεί να υιοθετηθεί από τους αθλητές ως μέθοδος κάλυψης του ντόπινγκ κατά τη δειγματοληψία με στόχο να επηρεάσει το προφίλ απέκκρισης απαγορευμένων ουσιών και επομένως να εμποδίσει την ανίχνευσή τους.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εκτιμηθεί ο ρόλος της υπερενυδάτωσης ως πιθανής μεθόδου κάλυψης της χρήσης απαγορευμένων ουσιών, αξιολογώντας την επίδραση στο αιματολογικό και στεροειδές προφίλ των αθλητών (Αthlete Βiological Ρassport), στα επίπεδα της ενδογενούς ωχρινοτρόπου ορμόνης (Luteinizing Hormone) στα ούρα καθώς και στο φαρμακονιητικό προφίλ στο αίμα και στα ούρα και στην ικανότητα ανίχνευσης δύο αντιπροσωπευτικών απαγορευμένων ουσιών, της Epoetin beta (rHuEPO) και του budesonide (BDS) μετά από υποδόρια και δια του στόματος χορήγηση, αντίστοιχα.Η παρουσίαση των αποτελεσμάτων της μελέτης είναι δομημένη σε τρία μέρη (Α-Γ). Στο πρώτο μέρος, «Μέρος Α: Εισαγωγή & Σχεδιασμός Μελέτης», παρουσιάζεται η λογική της μελέτης και η περιγραφή του πρωτοκόλλου και της μεθοδολογίας μαζί με τον σκοπό και τους στόχους της μελέτης, ως «Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή» και «Κεφάλαιο 2 : Σχεδιασμός μελέτης και μεθοδολογία». Το πλήρες πρωτόκολλο της μελέτης, όπως εγκρίθηκε από την Επιτροπή Υγείας, Ιατρικής και Έρευνας του Παγκόσμιου Οργανισμού Αντι-Nτόπινγκ (10D21CG) και από την Επιτροπή Ηθικής του Εργαστηρίου Αντι-Ντόπινγκ του Κατάρ (F2013000006) παρουσιάζεται στο Παράρτημα Γ.Εν συντομία, επτά υγιείς, Καυκάσιοι, μη καπνιστές άνδρες συμμετείχαν σε όλες τις φάσεις της μελέτης. Η μελέτη περιελάμβανε τις ακόλουθες φάσεις: μια βασική φάση, δηλαδή χωρίς χορήγηση φαρμάκου, με και χωρίς υπερενυδάτωση και δύο φάσεις φαρμάκου, δηλαδή χορήγηση φαρμάκου με και χωρίς υπερενυδάτωση. Ο στόχος της βασικής φάσης ήταν να εξεταστεί η επίδραση της υπερενυδάτωσης στα προφίλ συγκέντρωσης στο αίμα και στα ούρα ενδογενών ουσιών όπως ενδογενή αναβολικά ανδρογόνα στεροειδή, ενδογενής ερυθροποιητίνη, ενδογενής ωχρινοτρόπος ορμόνη καθώς και στους αιμοδυναμικούς δείκτες που περιλαμβάνονται στο αιματολογικό προφίλ των αθλητών. Σκοπός της φάσης χορήγησης του φαρμάκου ήταν η διεξαγωγή φαρμακοκινητικής μελέτης για κάθε μια από τις επιλεχθείσες απαγορευμένες φαρμακευτικές ουσίες, δηλαδή της rHuEPO και του BDS μετά τη χορήγηση μίας εφάπαξ δόσης, προκειμένου να εξετασθεί η επίδραση υπερενυδάτωσης στα προφίλ συγκέντρωσης-χρόνου και στην ικανότητα ανίχνευσης κάθε ουσίας κατά την ανάλυση ελέγχου ντόπινγκ.Η υπερενυδάτωση εφαρμόσθηκε είτε με νερό είτε με αθλητικό ποτό με λήψη 20 mL/kg σωματικού βάρους (1400 mL για άτομο βάρους 70 kg) σε διάτημα 30 λεπτών.Η συλλογή και αποθήκευση δειγμάτων ούρων και αίματος διεξήχθη σύμφωνα με τις επίσημες οδηγίες του Παγκόσμιου Οργανισμού Αντι-Nτόπινγκ, ακολουθώντας το πρόγραμμα δειγματοληψίας όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο της μελέτης. Όλες οι αναλύσεις δειγμάτων αίματος και ούρων πραγματοποιήθηκαν με τις επικυρωμένες αναλυτικές μεθόδους σύμφωνα με τις επίσημες οδηγίες του Παγκόσμιου Οργανισμού Αντι-Nτόπινγκ.Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό πρόγραμμα SPSS 25.0 (IBM SPSS Statistics για Windows, Έκδοση 25.0, IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Το λογισμικό Phoenix® έκδοση 8.0 PK / PD (Certara, Princeton, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των φαρμακοκινητικών δεδομένων. Σε όλες τις περιπτώσεις εφαρμόσθηκε μη διαμερισματική φαρμακοκινητική ανάλυση (Non-compartmental analysis, NCA) ενώ για την rHuEPO πραγματοποιήθηκε και φαρμακοκινητική μοντελοποίηση.Το δεύτερο και τρίτο μέρος της μελέτης (Μέρη B & Γ) διαρθρώνονται σε κεφάλαια τα οποία είναι δομημένα ώστε να μπορούν να διαβαστούν ανεξάρτητα. Πιο συγκεκριμένα:«Μέρος Β: Η επίδραση της υπερενυδάτωσης των αθλητών στις αιματολογικές παραμέτρους και το προφίλ συγκέντρωσης στα ούρα ενδογενών βιοδεικτών που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση ντόπινγκ», αποτελείται από τρία κεφάλαια που περιγράφουν την επίδραση της υπερενυδάτωσης στο αιματολογικό προφίλ των αθλητών (Κεφάλαιο 3), στο στεροειδές προφίλ των αθλητών, (Κεφάλαιο 4) και στα επίπεδα της ενδογενούς ωχρινοτρόπου ορμόνης στα ούρα (Κεφάλαιο 5), αντίστοιχα, ως εξής:Κεφάλαιο 3: Επίδραση της υπερενυδάτωσης στις αιματολογικές παραμέτρους του βιολογικού διαβατηρίου των αθλητών (Athlete Biological Passport)Το Athlete Biological Passport είναι μια έμμεση προσέγγιση, η οποία εφαρμόζεται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Αντι-Nτόπινγκ, με στόχο την ανίχνευση χειραγώγησης των δειγμάτων αίματος με βάση τις μη φυσιολογικές αλλαγές στους αιματολογικούς δείκτες. Περιπτώσεις ντόπινγκ αναφέρουν τη χρήση της υπερενυδάτωσης από τους αθλητές ως μέθοδο κάλυψης του ντόπινγκ κατά τη συλλογή δειγμάτων ούρων, η οποία θα μπορούσε ενδεχομένως να καλύψει τις ύποπτες διακυμάνσεις στα αιματολογικά προφίλ. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε την επίδραση της υπερενυδάτωσης στους αιματολογικούς δείκτες, δηλαδή συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης, ποσοστό δικτυοκυττάρων και OFF-hr, με και χωρίς χορήγηση rHuEPO. Οι επτά υγιείς, καθμερινά αθλούμενοι εθελοντές συμμετείχαν για μια περίοδο πέντε εβδομάδων, εκ των οποίων οι δυο πρώτες αφορούσαν στη βασική φάση και οι επόμενες τρεις στη φάση χορήγησης rHuEPO. Το νερό και ένα εμπορικά διαθέσιμο αθλητικό ποτό χρησιμοποιήθηκαν ως παράγοντες υπερενυδάτωσης σε όγκο 20 mL/kg σωματικού βάρους. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μελέτης, για να εξεταστεί η επίδραση της υπερενυδάτωσης στο φυσιολογικό αιματολογικό προφίλ κάθε εθελοντή, εφαρμόστηκε υπερενυδάτωση στις 0, 24 και 48 ώρες κατά τη διάρκεια της βασικής φάσης. Κατά τη διάρκεια της φάσης χορήγησης rHuEPO, οι εθελοντές έλαβαν μία δόση 3000 IU Epoetin beta χωρίς και με κάθε παράγοντα υπερενυδάτωσης πο