Physiological investigation of somatic embryogenesis in carob (Ceratonia siliqua L.)

Somatic embryogenesis is the process with which somatic cells, under appropriate conditions create embryonic cells that undergo a series of morphological and biochemical changes, resulting to the development of somatic embryos. The somatic embryos are bipolar structures, containing an embryonic root-shoot axis with a closed, independent vascular system. The somatic embryos might be created by either direct somatic embryogenesis or indirect somatic embryogenesis. The somatic embryogenesis is based on the cell dynamics of higher plants. The induction conditions include appropriate nutrients, plant-developing regulators, light regulation and adjustment of the plant species to nutrients. The cultivation conditions of somatic embryos are controlled and the lack of material is not a restricting factor to the experiment. The above mentioned characteristics have turned somatic embryogenesis of higher plants into a model for morphological, physiological, molecular and biochemical developmental processes.In the present Ph D Thesis explants of carob tree (Ceratonia siliqua L.) that produced somatic embryos have been studied in laboratory conditions. In addition, the development of somatic embryos has been studied in relation to nutrients, plant growth regulators, sugar concentrations, irradiance conditions (presence and absence of light) and temperature. The results showed that different calli (forms and sizes) have been derived from cotyledons and embryos of mature seeds, from hypocotyls, roots and young shoots that are coming thought enlarged and germinated mature seeds. Some calli have developed shoots and roots; form these tissues young plantlets were developed, but somatic embryos were not. In other words, tissues form mature seeds exhibit morphogenetic dynamics, but they lack of embryogenic dynamics. Immature carob tree seeds have undergone the same cultivation conditions as described for the mature seeds, in order to study the role of the explants’ age in the embryogenic development. The results showed that the cotyledons and the body of the zygotic embryos of immature seeds lead to indirect somatic embryogenesis from embryogenic callus and direct somatic embryogenesis from the enlarged tissue. Somatic embryos were developed by adding 6-benzylaminopurine (BA). It is likely that BA concentrations (10 μΜ) are able to induce somatic embryogenesis. Very small auxin concentrations combined to BA either enhance somatic embryogenesis (especially the direct one) or are indifferent. The percentage of somatic embryos that develop with the addition of BA is larger than the percentage of somatic embryos that develop with the addition of BA and auxin. Along the different auxin types that have been used, only the addition of napthyl acetic acid (NAA) in concentrations larger than those of BA conduced to the development of somatic embryos. Somatic embryos that have been develop only under BA come from direct embryogenesis and are in a very good shape, while somatic embryos that develop under a combination of plant-growth regulators are few, direct or indirect, anomalous, with fused cotyledons. The enlarged tissues that are going to produce somatic embryos show limited callogenesis and shoot development.The next experimental steps included the enhancement of the somatic embryogenesis and the accurate determination of the immature seeds that produced more and good quality somatic embryos, which are able to germinate and to develop plantlets. Immature seeds were collected monthly from the same trees that had been used as sources of the mature seeds. It has been proved that whole zygotic embryos derived from immature seeds, 1-3 mm in length and collected in February, showed substantial embryogenic ability, even in the absence of plant growth regulators in the media. Half zygotic embryos derived from immature seeds, 4-5 mm in length and collected in March, were placed at their upper side in nutrient M.S., where different concentrations of plant growth regulators were added (i.e. BA, combinations of BA with 3-indole-butyric acid, ΝΑΑ, 2,4 dichlorophenoxy acetic acid) in darkness. The results showed large numbers of normal and irregular somatic embryos. A large percentage of those somatic embryos germinated and plantlets have been developed in M.S. nutrient without plant growth regulators. The induction of sized somatic embryos that derive from zygotic embryos and their cotyledons has not yet been published in the literature. In addition, seeds that were placed in large BA concentrations for a few hours and have been transferred in full-strength and half-strength MS nutrients with sucrose, and enriched with different ΝΑΑ, 2,4-D and ΙΒΑ concentrations, produced substantial percentages of somatic embryos. A large percentage of somatic embryos has been developed by the transfer of calli and enlarged tissues developed under various BA concentrations to darkness, to different auxin concentrations for 40-50 days. The placement of the explants for 15 days in M.S. without plant growth regulators and their cultivation in nutrients with plant growth regulators resulted in larger percentages of somatic embryogenesis. Parts of embryos and cotyledons that derived from green immature seeds, 5-8 mm in length and collected in April, produced considerable percentages of somatic embryogenesis combined with BA and IBA, while smaller production has been measured in combinations of BA with ΝΑΑ, GA3 and 2,4-D. The experiments of the current thesis showed the important embryogenic action of BA in combination with 2, 4-D. The cultivation of seeds that have previously undergone cold stress (4-6 οC) for a three-month period has enhanced callogenesis, genesis of shoots and roots. According to the present study only a part of plant cells can be turned to embryogenic cells and only a part of the embryogenic cells can be transformed to embryos. Parts of enlarged embryos, cotyledons, embryonic calli and cotyledons that derive from immature seeds (> 8 mm in length) did develop irregular somatic embryos in small percentages. In this age, the appearance of somatic embryogenesis from explants delays more than three months and the percentage of those explants is very small compared to the younger explants. An interesting fact is the development of many direct primary somatic embryos in roots, which have been developed by cotyledon calli, created by transferring the enlarged cotyledons from M.S. nutrients with 1 μΜ ΒΑ to M.S. nutrients with 1,25 μΜ ΝΑΑ, after 40 days. Independently of the way somatic embryos have been produced, they showed morphological irregularities, e.g. numerous and fused cotyledons. Some embryos formed buds which developed shoots and were differentiated to multiple shots in nutrients that did not contain plant growth regulators. At the next stage complete small plants were developed from somatic embryos that derived from a variety of cultivated conditions. The best quality of plantlets was derived from somatic embryos developed in BA. Therefore, the initial plantlets’ processing is important for the quality of plants. Also, a 3D imaging process was used for somatic embryos and roots derived from the above mentioned cultivating conditions. The deeper understanding of the mechanisms that controls the plants’ growth and development requires the knowledge of quantitative results in order to produce 3D morphology and understand genes activity in different stages and conditions. 3D imaging of somatic embryos and small carob tree roots was realized with the usage of an experimental optical screening scanner and white light. This technique offers accurate statistics for the morphology, the structural elements and the regions of gene expressing in different developmental stages. In conclusion, the presence of BA at concentrations of 5 μM and 10 μM induces somatic embryogenesis in immature seeds 1-3 mm in length, immature seeds 4-5 mm in length and cut along the main axis, in the body of somatic embryos and their cotyledons derived from seeds 5 mm in length. Parts of cotyledons and embryos of the above mentioned explants possess embryogenic dynamics in M.S. without adding plant growth regulators and produce elevated percentages of good quality somatic embryos, direct or indirect, primary or secondary. These somatic embryos were developed at cotyledon stage and produced whole plantlets with shoots and roots in the tubes. In the presence of BA combined with 2,4-D and IBA there was enlargement of immature seeds 1-3 mm in length and direct somatic embryogenesis was induced even on the body and the cotyledons of the zygotic embryos. In the case that the nutrients contain BA combined with ΝΑΑ, 2, 4-D, ΙΒΑ at a photoperiod 16 h as well in darkness, then direct and indirect somatic embryogenesis was induced in immature seeds (4-5 mm in length). The above mentioned somatic embryos were developed and at the same time roots were elongated in M.S. nutrients without plant growth regulators; also, small plantlets were developed in cultivation tubes. Somatic embryogenesis was induced by: a) the use of ΒΑ 100 μΜ or 200 μΜ for 2-3 h in half seeds 4-5 mm in length or half zygotic embryos, b) immature seeds 5-8 mm in length or half zygotic embryos and c) immature seeds (> 8 mm in length) and cultivated in different concentrations of ΝΑΑ, 2, 4-D, ΙΒΑ and GA3. The sole presence of ΝΑΑ, 2, 4-D, ΙΒΑ and GA3 without former presence of BA generally cannot create embryogenetic dynamics. The presence of M.S. in nutrients without plant growth regulators induced somatic embryogenesis at small percentage in immature seeds 1-3 mm in length, as well in half seeds 4-5 mm in length. In that developing stage, zygotic embryos and cotyledons exhibited large embryogenic dynamics. The somatic embryos developmental ability is reduced with the growing age of immature seeds. Embryos, cotyledons and hypocotyls of mature seeds do not possess embryogenic dynamics, but it seems likely that they preserve the ability of creation of calli, shoots and roots. Important factors of somatic embryogenesis induction are the application time and the presence of BA in the media. Cultivation of zygotic embryos and parts of cotyledons from immature seeds (> 8 mm in length) in M.S. nutrients that contain auxins (ΝΑΑ, 2,4-D, ΙΒΑ and GA3) as well the transport of calli and the enlarged explants in M.S. nutrients with cytokinin BA favored the genesis of shoots in elevated percentage and did not favor somatic embryogenesis.Η σωματική εμβρυογένεση είναι η διαδικασία με την οποία σωματικά κύτταρα, κάτω από κατάλληλες επαγωγικές συνθήκες, δημιουργούν εμβρυογενετικά κύτταρα, τα οποία υπόκεινται σε μια σειρά από μορφολογικές και βιοχημικές αλλαγές, που έχουν σαν αποτέλεσμα τη διαμόρφωση σωματικών εμβρύων. Τα σωματικά έμβρυα εμφανίζουν διπολική δομή, που περιλαμβάνει εμβρυϊκό άξονα ρίζας-βλαστού, με κλειστό, ανεξάρτητο αγγειακό σύστημα. Τα σωματικά έμβρυα μπορεί να δημιουργηθούν άμεσα επάνω στο έκφυτο (direct somatic embryogenesis) ή έμμεσα με σχηματισμό κάλλου (indirect somatic embryogenesis). Η σωματική εμβρυογένεση έχει τη βάση της στην ολοδυναμία των κυττάρων, ιδιότητα που έχουν μόνο τα ανώτερα φυτά. Οι συνθήκες επαγωγής περιλαμβάνουν το κατάλληλο θρεπτικό μέσο, τον κατάλληλο συνδυασμό φυτοαυξητικών ρυθμιστών, τη ρύθμιση της παροχής ή όχι φωτός, τον τρόπο τοποθέτησης του εκφύτου στο θρεπτικό μέσο. Τα σωματικά έμβρυα είναι εύκολο να υποστούν χειρισμούς, οι συνθήκες καλλιέργειάς τους μπορούν να ελεγχθούν και η έλλειψη υλικού δεν είναι περιοριστικός παράγοντας για τον πειραματισμό. Αυτά τα χαρακτηριστικά έχουν κάνει τη σωματική εμβρυογένεση ένα πρότυπο (μοντέλο) για τη μελέτη μορφολογικών, φυσιολογικών, μοριακών και βιοχημικών διεργασιών που συμβαίνουν κατά την έναρξη και την ανάπτυξη της εμβρυογένεσης στα ανώτερα φυτά. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν έκφυτα χαρουπιάς (Ceratonia siliqua L.) στο εργαστήριο, που έδιναν εμβρυογενετικά κύτταρα και σωματικά έμβρυα. Επίσης μελετήθηκε ο τύπος του θρεπτικού μέσου, συνδυασμοί φυτοαυξητικών ρυθμιστών, παρουσία ή απουσία φωτός, συγκεντρώσεις σακχάρων και η επίδραση της θερμοκρασίας στην ανάπτυξη σωματικών εμβρύων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι από τμήματα κοτυληδόνων και εμβρύων ώριμων σπερμάτων, από υποκοτύλια, ρίζες και νεαρούς βλαστούς που προέκυψαν από τη διόγκωση και βλάστηση των ώριμων σπερμάτων προέκυψαν κάλοι διαφόρων μορφών και μεγεθών. Σε ορισμένους από αυτούς τους κάλλους αναπτύχθηκαν βλαστοί και ρίζες και από αυτούς τους ιστούς με κατάλληλη κατεργασία αναπτύχθηκαν νεαρά φυτάρια χωρίς όμως δημιουργία σωματικών εμβρύων. Αυτό σημαίνει πως οι ιστοί από τα ώριμα σπέρματα ενώ διαθέτουν μορφογενετικό (ριζογενετικό και βλαστογενετικό) δυναμικό δεν διαθέτουν εμβρυογενετικό δυναμικό. Σε παλαιότερη εργασία με ώριμα σπέρματα χαρουπιάς φάνηκε μόνο η ικανότητα δημιουργίας κάλλου, χωρίς βλαστογενετικό και ριζογενετικό δυναμικό. Ενδεχομένως, οι διαφορές αυτές οφείλονται στις συνθήκες καλλιέργειας ή στο γενετικό υπόβαθρο των εκφύτων. Σε ένα δεύτερο στάδιο, χρησιμοποιήθηκαν ανώριμα σπέρματα χαρουπιάς με τις ίδιες καλλιεργητικές συνθήκες με εκείνες για τα ώριμα σπέρματα, για να διαπιστωθεί ο ρόλος της ηλικίας του εκφύτου στη δημιουργία εμβρυογενετικού δυναμικού. Αποδείχτηκε πως από τις κοτυληδόνες και το σώμα των ζυγωτικών εμβρύων των ανώριμων σπερμάτων προέκυπτε σωματική εμβρυογένεση έμμεση από εμβρυογενετικό κάλλο και άμεση κατευθείαν από το διογκωμένο ιστό. Παρατηρήθηκε, με προσθήκη της κυτοκινίνης ΒΑ, ανάπτυξη σωματικών εμβρύων. Απ’ ότι φαίνεται η παρουσία της ΒΑ μέχρι τη συγκέντρωση 10 μΜ είναι από μόνη της ικανή να επάγει σωματική εμβρυογένεση. Οι πολύ μικρές συγκεντρώσεις αυξίνης σε συνδυασμό με την ΒΑ ή διευκολύνουν τη σωματική εμβρυογένεση και μάλιστα την άμεση, ή είναι αδιάφορες. Τα ποσοστά σωματικών εμβρύων που αναπτύσσονται μόνο σε ΒΑ είναι μεγαλύτερα σε σχέση με αυτά που αναπτύσσονται στο συνδυασμό ΒΑ και αυξίνης. Από τις αυξίνες που χρησιμοποιήθηκαν, το ΝΑΑ οδήγησε σε ανάπτυξη ελάχιστων σωματικών εμβρύων σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από αυτές της ΒΑ. Τα σωματικά έμβρυα που αναπτύσσονται μόνο σε ΒΑ είναι άμεσης εμβρυογένεσης και πολύ καλής ποιότητας, ενώ αυτά που αναπτύσσονται στο συνδυασμό των φυτοαυξητικών ρυθμιστών είναι λίγα και άμεσα ή έμμεσα, ανώμαλα με συντηγμένες κοτυληδόνες Όταν ο διογκωμένος ιστός πρόκειται να δώσει σωματικά έμβρυα, τότε εμφανίζει περιορισμένη καλλογένεση και βλαστογενέση.Σε ένα τρίτο στάδιο έγινε προσπάθεια να βελτιστοποιηθεί ποσοστιαία η σωματική εμβρυογένεση, να προσδιοριστεί με σχετική ακρίβεια η ηλικία των ανώριμων σπερμάτων που εμφάνιζαν τα περισσότερα και καλύτερης ποιότητας σωματικά έμβρυα, με μεγαλύτερη ικανότητα βλάστησης και ανάπτυξης φυταρίων. Προς αυτήν την κατεύθυνση έγινε συστηματική μηνιαία δειγματοληψία ανώριμων σπερμάτων πάντα από τα ίδια δέντρα της ίδιας περιοχής με αυτά από τα οποία είχε γίνει η λήψη των ώριμων σπερμάτων. Απεδείχθη ότι από τα πολύ ανώριμα σπέρματα όπως τις γονιμοποιημένες σπερματικές βλάστες δεν προέκυψε κάποια αντίδραση, εκτός από σπάνια καλλογένεση. Ολόκληρα ζυγωτικά έμβρυα από ανώριμα σπέρματα μήκους 1-3 mm που είχαν συλλεχθεί το Φεβρουάριο εμφανίζουν έντονη εμβρυογενετική ικανότητα, ακόμη και σε θρεπτικό μέσο χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές, γεγονός που δεν έχει αναφερθεί στη μέχρι τώρα βιβλιογραφία. Από μισά ζυγωτικά έμβρυα από ανώριμα σπέρματα μήκους 4-5 mm που είχαν συλλεχθεί το Μάρτιο κομμένα στον οβελιαίο άξονα και τοποθετημένα με την απαξονική πλευρά τους σε θρεπτικό μέσο Μ.S. και με ποικιλία συγκεντρώσεων φυτοαυξητικών ρυθμιστών ΒΑ, καθώς και συνδυασμό ΒΑ με ΙΒΑ, ΝΑΑ, 2,4-D κυρίως σε σκοτάδι, προέκυψαν μεγάλα ποσοστά σωματικών εμβρύων φυσιολογικών αλλά και ανώμαλων. Αυτά τα σωματικά έμβρυα βλάστησαν, ριζοβόλησαν και αναπτύχθηκαν περαιτέρω σε μικρά φυτάρια σε θρεπτικό μέσο Μ.S., χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές σε μεγάλο ποσοστό. Η επαγωγή σωματικών εμβρύων από ζυγωτικά έμβρυα και τις κοτυληδόνες τους, αυτού του μεγέθους σπερμάτων δεν είχε προηγουμένως αναφερθεί. Επιπλέον από σπέρματα που τοποθετήθηκαν σε μεγάλες συγκεντρώσεις ΒΑ για λίγες ώρες και τα οποία μεταφέρθηκαν σε ολοδύναμο ή ημιδύναμο θρεπτικό μέσο M.S. με ποικιλία σακχαρόζης, εμπλουτισμένο με διάφορες συγκεντρώσεις ΝΑΑ, 2,4-D και ΙΒΑ προέκυψε μεγάλο ποσοστό σωματικών εμβρύων. Επιπλέον, μεγάλο ποσοστό σωματικών εμβρύων επετεύχθη με τη μεταφορά κάλλων και διογκωμένων ιστών από διάφορες συγκεντρώσεις ΒΑ στο σκοτάδι κυρίως σε διάφορες συγκεντρώσεις αυξινών μετά την παρέλευση 40-50 ημερών. Από τους χειρισμούς με προηγούμενη παραμονή των εκφύτων για 15 περίπου ημέρες σε Μ.S. χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές και η μετέπειτα καλλιέργειά τους σε θρεπτικό μέσο με φυτοαυξητικούς ρυθμιστές προέκυψαν πολύ μεγαλύτερα ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης. Από τμήματα εμβρύων και κοτυληδόνων, που απομονώθηκαν από πράσινα ανώριμα σπέρματα μήκους 5-8 mm που συλλέχτηκαν τον Απρίλιο προέκυψαν αξιόλογα ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης σε συνδυασμούς ΒΑ και ΙΒΑ, ενώ μικρότερα ποσοστά σε συνδυασμούς ΒΑ με ΝΑΑ, GA3 και 2,4-D. Γενικά σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η παρουσία της 2,4-D, φαινόταν ότι ήταν εντελώς ακατάλληλη. Τα πειράματα που έγιναν έδειξαν την σημαντική εμβρυογενετική δράση του συνδυασμού ΒΑ και 2,4-D. Καλλιέργεια σπερμάτων που είχαν υποστεί καταπόνηση ψύχους (4-6 οC) για χρονικό διάστημα 3 μηνών ευνόησε καλλογένεση, βλαστογένεση και ριζογένεση, όχι όμως και σωματική εμβρυογένεση. Αν και παλαιότερες εργασίες υπέθεταν ότι όλα τα φυτικά κύτταρα ήταν εξίσου ολοδύναμα, τα στοιχεία δείχνουν ότι μόνο ένα υποσύνολο των φυτικών κυττάρων μπορεί να μετατραπεί σε εμβρυογενετικά κύτταρα και μόνον ένα τμήμα αυτών μπορούν να εξελιχθούν σε έμβρυα. Σε τμήματα διογκωμένων εμβρύων, κοτυληδόνων, κάλλων από έμβρυα και κοτυληδόνες που είχαν προκύψει από καλλιέργεια ανώριμων σπερμάτων μήκους μεγαλύτερου των 8 mm αναπτύχθηκαν ανώμαλα σωματικά έμβρυα σε μικρό ποσοστό. Στην ηλικία αυτή των εκφύτων καθυστερεί η εμφάνιση σωματικής εμβρυογένεσης περισσότερο από 3 μήνες και το ποσοστό αυτών είναι πολύ μικρό σε σχέση με τα έκφυτα νεότερης ηλικίας. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η ανάπτυξη πολλών άμεσων πρωτογενών σωματικών εμβρύων στις ρίζες που αναπτύχθηκαν από κάλο κοτυληδόνας που είχε δημιουργηθεί μετά από μεταφορά διογκωμένης κοτυληδόνας από 1 μΜ ΒΑ σε θρεπτικό μέσο M.S. και 1,25 μΜ ΝΑΑ, μετά από 40 περίπου ημέρες. Ανεξάρτητα από τον τρόπο δημιουργίας των σωματικών εμβρύων αυτά παρουσιάζουν μορφολογικές ανωμαλίες, όπως για παράδειγμα περισσότερες κοτυληδόνες από δύο ή και σύντηξη των κοτυληδόνων. Μερικά έμβρυα παρουσίασαν σχηματισμό οφθαλμών από τους οποίους αναπτύσσονται βλαστοί και διαφοροποιήθηκαν σε πολλαπλούς βλαστούς στο θρεπτικό μέσο χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές.Σε ένα τέταρτο στάδιο αναπτύχθηκαν μικρά πλήρη φυτά από σωματικά έμβρυα που είχαν αποκτηθεί με ποικιλία καλλιεργητικών συνθηκών. Η καλύτερη ποιότητα φυταρίων προέκυψε από σωματικά έμβρυα που αναπτύχθηκαν μόνον παρουσία της ΒΑ. Επομένως η αρχική κατεργασία των εκφύτων παίζει σημαντικό ρόλο στη μετέπειτα ποιότητα των φυτών. Σε ένα πέμπτο στάδιο έγινε τρισδιάστατη απεικόνιση σωματικών εμβρύων και ριζών που είχαν προκύψει με τις παραπάνω καλλιεργητικές συνθήκες. Η βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την αύξηση και την ανάπτυξη των φυτών απαιτεί ποσοτικά στοιχεία για την τρισδιάστατη μορφολογία και τη δραστηριότητα των γονιδίων σε διάφορα στάδια και κλίμακες. Η οπτική τομογραφία προβολής μπορεί να εφαρμόζεται σε μια ευρεία ποικιλία φυτικού υλικού και σε διαβάθμιση κλίμακας, συμπεριλαμβανομένων φυτών, φύλλων, ανθέων, ριζών, σπερμάτων, εμβρύων και μεριστωμάτων. Η οπτική τομογραφία προβολής είναι μια τεχνική που επιτρέπει την τρισδιάστατη απεικόνιση ενός βιολογικού δείγματος. Με το σύστημα αυτό είναι δυνατόν να προκύψουν ακριβή στατιστικά στοιχεία σχετικά με τη μορφολογία, θέσεις δομικών στοιχείων και περιοχών γονιδιακής έκφρασης σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης. Η τεχνική μπορεί να προσφέρει ποσοτικά στοιχεία για την ανάλυση της σχέσης μεταξύ της ανάπτυξης και του σχηματισμού προτύπων. Με πειραματική συσκευή Οπτικής Τομογραφίας Προβολής και με χρήση λευκού φωτός, έγινε τρισδιάστατη απεικόνιση σωματικών εμβρύων και μικρών ριζιδίων χαρουπιάς. Συνοψίζοντας, φαίνεται πως η παρουσία μόνον της κυτοκινίνης ΒΑ σε συγκεντρώσεις 5 μΜ και 10 μΜ είναι ικανή να επάγει σωματική εμβρυογένεση σε ανώριμα σπέρματα μήκους 1-3 mm, ανώριμα σπέρματα μήκους 4-5 mm και κομμένα κατά μήκος, στο σώμα ζυγωτικών εμβρύων και στις κοτυληδόνες τους, που απομονώθηκαν από σπέρματα 5 mm. Τμήματα κοτυληδόνων και εμβρύων των παραπάνω εκφύτων έχουν μεγάλο εμβρυογενετικό δυναμικό σε Μ.S. χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές και παράγουν σωματικά έμβρυα σε μεγάλο ποσοστό, καλής ποιότητας, έμμεσα και άμεσα, πρωτογενή και δευτερογενή, τα οποία αναπτύσσονται σε στάδιο κοτυληδόνων και δίνουν πλήρη φυτάρια με βλαστό και ρίζες σε πειραματικές συνθήκες (π.χ. στο σωλήνα καλλιέργειας). Παρουσία ΒΑ σε συνδυασμό με 2,4-D και ΙΒΑ προκύπτει διόγκωση και ρήξη ανώριμων σπερμάτων μήκους 1-3 mm και επάγεται σωματική εμβρυογένεση άμεση ακόμη και πάνω στο σώμα και τις κοτυληδόνες των ζυγωτικών εμβρύων. Με την παρουσία ΒΑ στο θρεπτικό μέσο, σε συνδυασμό με ΝΑΑ, 2,4-D, ΙΒΑ τόσο σε φωτοπερίοδο 16 h, όσο και σε σκοτάδι επάγεται σωματική εμβρυογένεση άμεση και έμμεση σε ανώριμα σπέρματα 4-5 mm κατά μήκος κομμένα. Τα σωματικά αυτά έμβρυα στην πλειονότητά τους αναπτύσσονται και βλαστάνουν με ταυτόχρονη δημιουργία ριζών σε Μ.S. χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές και μικρά φυτάρια αναπτύσσονται στο σωλήνα καλλιέργειας. Η καταπόνηση με επαγωγή ΒΑ 100 μΜ ή 200 μΜ για 2-3 ώρες μισών σπερμάτων μήκους 4-5 mm ή μισών ζυγωτικών εμβρύων και των κοτυληδόνων τους κομμένων στον επιμήκη άξονα, από ανώριμα σπέρματα μήκους 5-8 mm ή των μισών ζυγωτικών εμβρύων και των κοτυληδόνων τους κομμένων σε τέσσερα τμήματα από ανώριμα σπέρματα μήκους μεγαλύτερου των 8 mm και η καλλιέργειά τους στη συνέχεια σε διάφορες συγκεντρώσεις α