Kinetic studies of polysaccharides and lipids biosynthesis during the cultivation of macromycetes

The physiological behaviour of several edible and medicinal fungi, grown basically in liquid cultures, was investigated. Specifically, the production of mycelial mass, the substrate consumption, the accumulation and (in some cases) the degradation of intracellular compounds like polysaccharides and lipids, as well as the secretion of exopolysaccharides (EPS) was studied, with special attention given in the macromycetous Volvariella volvacea. Intensive literature survey showed relative lack of comparative data on the physiological behaviour and biosynthetic capacity of edible and medicinal fungi in liquid synthetic culture media. Initially, 9 basidiomycetes (Ganoderma lucidum, G. applanatum, Auricularia auricula-judae, Lentinula edodes, Flammulina velutipes, Pleurotus pulmonarius, P. ostreatus, Agrocybe aegerita, V. volvacea) and 2 ascomycetes (Morchella elata, M. esculenta) were evaluated by examining their ability to produce mycelial mass, exopolysaccharides (EPS) and lipids in liquid static- and shake-flask cultures at various culture media based on glucose. High values of dry mycelial mass (~ 13-19 g/l), EPS (~ 1.0-1.3 g/l) and lipids (up to 22.0%, w/w, in dry matter) were reported for several of the studied strains. Fatty acid (FA) analysis of cellular lipids showed high concentrations of linoleic acid for most of the strains studied. By this way, the 6 most interesting species (P. pulmonarius, G. applanatum, F. velutipes, A. aegerita, V. volvacea and M. esculenta) were selected and further kinetic analysis of growth and biosynthesis exo-and endo-polysaccharides (IPS) and lipids was made. Extension of the fermentation time resulted in higher concentrations of biomass, compared with the initial experiment (maximum biomass values ~20-22.5 g/l), whereas the conversion yield of biomass produced per glucose consumed (YX/Glc) was in several cases promising (0.6-0.9 g/g). Additionally, the maximum EPS values showed great variation depending on the strain and the application (or not) of agitation. Also, very high concentrations of IPS (e.g. 5.8-10.9 g/l), close to the maximum reported in the literature, were syntheses. IPS composition in simple sugars varied according to cultivation time and was characterized primarily by glucose and in smaller percentages by fructose, mannitol and xylitol. Relatively high concentrations of lipids (e.g. 20-22.5%, w/w) were recorded in the early growth stages (e.g. up to the 12th day after inoculation), while then degradation was observed. The main cellular FAs were linoleic (>50%, w/w) followed by oleic (up to 40%, w/w) and palmitic (10-30%, w/w). Differences in the FA composition related with the fermentation time and the application (or not) of agitation were revealed, with the profile of FAs being the most saturated in M. esculenta and V. volvacea fungi. In another series of experiments, the fungus V. volvacea was more extensively studied, by evaluating the mycelium growth rate of four V. volvacea strains (188, 190, 191 and 192) grown in Petri dishes and by assessing the production of mycelial mass for the above mentioned strains in liquid cultures. Analysis in the FA composition of fungal lipids demonstrated for all strains a non-negligible presence of low- and high-chain saturated FAs (e.g. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0), suggesting that this FA profile is typical for V. volvacea. Quantification of the fractions of the produced lipids showed for most strains relatively higher content of neutral lipids (NL), with glycolipids and sphingolipids (G+S) and principally phospholipids (PL) found in much smaller amounts. FA analysis of the fractions showed as most saturated fraction that of PL. Strain V. volvacea 190 was then grown in both agitated and static conditions and glucose consumption and biomass, IPS and EPS production were almost identical for both cultures. Only the production of lipids (in %, w/w) showed almost double value in agitated compared with static culture, while FA analysis of fungal lipids confirmed the previous findings. Quantification of lipid fractions at different stages of fungus growth cycle showed that, in the early stages of fermentation where higher amounts of lipids (%, w/w) were detected, the percentage of NL was higher and during lipid degradation process, selective consumption of NL along with an increase in G+S and PL occurred. Moreover, strain V. volvacea 190 was used to evaluate the effect of 10 different sources of carbon and nitrogen in its physiology. With initial sugar concentration of 30 g/l, high biomass production (14.5-15.2 g/l) was achieved with glucose and fructose employed as substrates in both agitated and static cultures and in starch (15.5 g/l) for agitated cultures, while satisfactory amounts of biomass (e.g. 11.3 g/l) accompanied by high yields YX/S (~0.7 g/g) were reported for xylose in static cultures. Much lower biomass production was recorded in the disaccharides maltose and sucrose, in both agitated and static cultures. Concerning nitrogen sources, peptone and yeast extract gave very satisfactory results, while low biomass was observed in urea, NH4NO3 and L-tryptophan. Regarding the production of EPS, the most satisfactory substrates were glucose and fructose in agitated conditions and xylose, starch and fructose in static ones. Interestingly, very satisfactory biosynthesis in EPS was performed in substrates that did not favour at all the production of biomass (e.g. maltose, sucrose). The concentration of IPS was depended on the employed carbon source, with glucose and fructose favouring the production of IPS under agitated and static conditions and starch in shake-flask experiments. Glucose was the main base-unit for the IPS synthesized, regardless of the substrate used. Biosynthesis and FA composition of total microbial lipids studied in various carbon and nitrogen sources used validated the previous results, while larger amounts of lipids (%, w/w) were reported in the early stages of growth (maximum lipid percentage ~18%, w/w) with the percentage of lipids being reduced remarkably with time. FA analysis of cellular lipids showed high content of linoleic acid, in many cases however, non-negligible presence of low-chain and high-chain and saturated FAs (e.g. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) was reported. The FA composition of V. volvacea AMRL 190 presented differences in relation with the individual sugars used as substrates. Also, quantification of the lipid fractions showed (relatively or remarkably) high content of the NL (47-65%, w/w, of total lipid), while in smaller amounts were detected the fractions of G+S and PL. Compositional analysis of PL showed differences related to the carbon sources used, while the main PL detected were the phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS). Finally, the macromycetous V. volvacea 190 was cultivated under increasing initial glucose concentrations (~30 to 95 g/l) and constant initial concentration of nitrogen. In the early stages of fermentation, increasing the initial ratio C/N (from 20 to 60) resulted in a marked increase in the percentage of intracellular lipid produced (from ~14% to ~31%, w/w), whereas the maximum concentration of biomass (maximum biomass value ~ 22 g/l for initial glucose concentration of 95 g/l) was also increased. However, biomass yield YX/Glc significantly decreased with the initial glucose concentration increase, while interestingly, glucose consumption rate (rGlc in g/l/d) significantly increased with the increase of glucose concentration into the medium. The increasing nitrogen restriction of the medium resulted in IPS biosynthesis in large and constantly increasing rates. The maximum IPS concentration was detected for initial glucose concentration 95 g/l and it was 12.2 g/l, a value compared with the highest values reported in the literature. Kinetic analysis of biosynthesis of intracellular lipids and polysaccharides showed a succession in the accumulation of the intracellular products, as initially relatively high concentrations of lipids were synthesized and then the progressive nitrogen limiting conditions led to increased accumulation of IPS with simultaneous degradation of intracellular lipids. In substrates with high C/N ratios, there was a high biosynthetic potential for production of fungal lipids rich in linoleic acid, while the presence of low- and high-chain saturated FAs (e.g. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) were greatly reduced. In line with previous findings, the PL fraction was the most saturated, whereas the main PL detected were PE, PI, PC and PS, the percentage of which changed with the C/N ratio and the time of fermentation. Finally, the composition in simple sugars of the produced IPS changed depended on the cultivation time, with glucose being the primary building block of intracellular polysaccharides.Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκαν οι φυσιολογικές παράμετροι της μικροβιακής αύξησης και μελετήθηκαν η παραγωγή μυκηλιακής μάζας, η κατανάλωση σακχάρων, η συσσώρευση και (σε κάποιες περιπτώσεις) η αποικοδόμηση ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών (IPS) και λιπιδίων και η έκκριση εξωπολυσακχαριτών (EPS) σε στελέχη εδώδιμων και φαρμακευτικών μακρομυκήτων καλλιεργούμενων κυρίως σε υγρές ζυμώσεις, με την έμφαση να δίνεται στις μελέτες για το μύκητα Volvariella volvacea. Ενδελεχής διερεύνηση της βιβλιογραφίας έδειξε σχετική έλλειψη συγκριτικών δεδομένων όσον αφορά στην φυσιολογική συμπεριφορά και τη βιοσυνθετική ικανότητα εδώδιμων και φαρμακευτικών μακρομυκήτων σε συνθετικά υγρά θρεπτικά μέσα. Σε ένα πρώτο επίπεδο, αξιολογήθηκαν 9 βασιδιομύκητες: Ganoderma lucidum, G. applanatum, Auricularia auricula-judae, Lentinula edodes, Flammulina velutipes, Pleurotus pulmonarius, P. ostreatus, Agrocybe aegerita, V. volvacea και 2 ασκομύκητες: Morchella elata, M. esculenta και μελετήθηκε συγκριτικά η ικανότητά τους για παραγωγή μυκηλιακής μάζας, EPS και λιπιδίων σε υγρές αναδευόμενες και μη-αναδευόμενες καλλιέργειες, σε διάφορα θρεπτικά μέσα με βάση τη γλυκόζη. Υψηλές τιμές ξηράς μυκηλιακής μάζας (~14-19 g/l), EPS (~1,0-1,3 g/l) και λιπιδίων (έως 22,0%, κ.β. επί ξηράς μάζας) αναφέρθηκαν για αρκετά από τα υπό μελέτη στελέχη. Η ανάλυση σε λιπαρά οξέα των κυτταρικών λιπιδίων των μακρομυκήτων έδειξε υψηλές συγκεντρώσεις του λινελαϊκού οξέος για τα περισσότερα από τα στελέχη που μελετήθηκαν. Έτσι, επιλέχθηκαν τα 6 πιο ενδιαφέροντα είδη (P. pulmonarius, G. applanatum, F. velutipes, A. aegerita, V. volvacea και M. esculenta) στα οποία πραγματοποιήθηκε ενδελεχής μελέτη της αύξησης και βιοσύνθεσης εξω- και ενδο-πολυσακχαριτών (IPS) και λιπιδίων. Επέκταση του χρόνου της ζύμωσης είχε ως αποτέλεσμα να επιτευχθούν υψηλότερες συγκεντρώσεις βιομάζας σε σχέση με το αρχικό πείραμα (μέγιστες τιμές μέχρι ~20-22,5 g/l), ενώ και ο συντελεστής απόδοσης της παραγόμενης βιομάζας προς την αναλωθείσα γλυκόζη (YX/Glc) ήταν σε αρκετές περιπτώσεις πολύ υψηλός (0,6-0,9 g/g). Επιπλέον, καταγραφή των μέγιστων τιμών των παραγόμενων EPS έδειξε μεγάλη διακύμανση ανάλογα το στέλεχος και την εφαρμογή ή όχι ανάδευσης. Ακόμα, παράχθηκαν σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις IPS (π.χ. 5,8-10,9 g/l), η σύσταση των οποίων σε απλά σάκχαρα μεταβαλλόταν σε συνάρτηση με το χρόνο της ζύμωσης και χαρακτηριζόταν κατά κύριο λόγο από γλυκόζη και σε μικρότερα ποσοστά από φρουκτόζη, μαννιτόλη και ξυλιτόλη. Σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδίων (σε % κ.β. επί ξηράς μυκηλιακής μάζας) καταγράφηκαν στα πρώιμα στάδια του αυξητικού κύκλου (μέχρι τη 12η ημέρα καλλιέργειας), φτάνοντας το 20,0-22,5%, κ.β. ενώ στη συνέχεια παρατηρήθηκε αποικοδόμησή τους. Η σύσταση των λιπιδίων, με κύριο λιπαρό οξύ το λινελαϊκό (ποσοστό >50%, κ.β.) και ακόλουθα τα ελαϊκό (έως 40%, κ.β.) και παλμιτικό (10-30%, κ.β.), εμφάνισε διαφοροποιήσεις σε σχέση με το χρόνο ζύμωσης και την εφαρμογή ή όχι ανάδευσης, με το προφίλ των λιπαρών οξέων να σημειώνεται πιο κορεσμένο στους M. esculenta και V. volvacea. Σε άλλη σειρά πειραμάτων, μελετήθηκε εκτενέστερα η φυσιολογία του μύκητα V. volvacea, με συγκριτική αξιολόγηση της ταχύτητας αύξησης του μυκηλίου τεσσάρων στελεχών του είδους (188, 190, 191 και 192) που καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Petri και σε υγρές ζυμώσεις, προκειμένου να αξιολογηθεί η παραγωγή μυκηλιακής μάζας για τα τέσσερα στελέχη. Ανάλυση του κυτταρικού λίπους σε λιπαρά οξέα για όλα τα στελέχη έδειξε μη-αμελητέα ύπαρξη χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0), υποδεικνύοντας ότι αυτού του είδους το προφίλ λιπαρών οξέων είναι χαρακτηριστικό για το είδος V. volvacea. Ποσοτικοποίηση των κλασμάτων των παραγόμενων λιπιδίων έδειξε σχετικά υψηλότερη περιεκτικότητα του ουδέτερου κλάσματος (NL) από ό,τι το κλάσμα των γλυκολιπιδίων και σφιγκολιπιδίων (G+S), ενώ σε πολύ μικρότερα ποσά ανιχνεύτηκαν τα φωσφολιπίδια (PL). Ανάλυση των κλασμάτων σε λιπαρά οξέα έδειξε ως πιο κορεσμένο κλάσμα αυτό των φωσφολιπιδίων. Στη συνέχεια, το στέλεχος 190 καλλιεργήθηκε σε αναδευόμενες και στατικές συνθήκες και τόσο η κατανάλωση της γλυκόζης, όσο και η παραγωγή βιομάζας, IPS και EPS ήταν σχεδόν ταυτόσημες για αμφότερες τις καλλιέργειες. Μόνο η παραγωγή λιπιδίων (σε % κ.β. επί ξηράς μάζας) εμφάνισε σχεδόν διπλάσιες τιμές στην αναδευόμενη σε σχέση με τη στατική καλλιέργεια, ενώ η ανάλυση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα επιβεβαίωσε τα προηγούμενα ευρήματα. Ποσοτικός προσδιορισμός των κλασμάτων στις διάφορες φάσεις του αυξητικού κύκλου έδειξε ότι στα πρώιμα στάδια της ζύμωσης όπου ανιχνεύτηκαν υψηλότερες ποσότητες λιπιδίων επί ξηράς μάζας, το ποσοστό του NL ήταν υψηλότερο και ενόσω καταναλώνονταν τα ενδοκυτταρικά λιπίδια, υπήρξε εκλεκτική κατανάλωση των NL με ταυτόχρονη αύξηση του ποσοστού των G+S και των PL. Επιπλέον, το στέλεχος V. volvacea 190 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της επίδρασης διαφορετικών πηγών C και Ν στη φυσιολογία του. Μεγάλη παραγωγή βιομάζας διαπιστώθηκε κατά την αύξησή του στη γλυκόζη και τη φρουκτόζη (14,5-15,2 g/l), τόσο σε αναδευόμενες όσο και σε στατικές καλλιέργειες, αλλά και στο άμυλο στις αναδευόμενες (15,5 g/l), ενώ ικανοποιητικές ποσότητες βιομάζας (π.χ. 11,3 g/l) και με υψηλό συντελεστή YX/Glc (~0,7 g/g) αναφέρθηκαν για την ξυλόζη στις στατικές καλλιέργειες. Πολύ μικρότερη παραγωγή βιομάζας σημειώθηκε στις μαλτόζη και σακχαρόζη, τόσο στις αναδευόμενες όσο και τις στατικές καλλιέργειες. Σχετικά με τις πηγές αζώτου, η πεπτόνη και το εκχύλισμα ζύμης έδωσαν πολύ ικανοποιητικά αποτελέσματα, ενώ περιορισμένη βιομάζα παρατηρήθηκε στην ουρία, το ΝΗ4ΝΟ3 και την L-τρυπτοφάνη. Σε ό,τι αφορά την παραγωγή των EPS, τα πιο ικανοποιητικά υποστρώματα ήταν οι γλυκόζη και φρουκτόζη υπό αναδευόμενες συνθήκες και οι ξυλόζη, άμυλο και φρουκτόζη υπό στατικές. Θα πρέπει να σημειωθεί ωστόσο ότι πολύ ικανοποιητική βιοσύνθεση EPS πραγματοποιήθηκε στα υποστρώματα που δεν ευνόησαν την παραγωγή βιομάζας. Η συγκέντρωση των IPS έδειξε να εξαρτάται από την πηγή C, με τις γλυκόζη και φρουκτόζη να ευνοούν την παραγωγή τους υπό αναδευόμενες και στατικές συνθήκες και το άμυλο υπό αναδευόμενες. Κύριο συστατικό των παραγόμενων πολυσακχαριτών αναδείχθηκε η γλυκόζη, ανεξάρτητα από το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε. H βιοσύνθεση και η σύσταση των συνολικών λιπιδίων που μελετήθηκαν στις διάφορες πηγές άνθρακα και αζώτου και σε διάφορα χρονικά σημεία της ζύμωσης ήταν σε συνάφεια με τα προηγούμενα αποτελέσματα, καθώς μεγαλύτερα ποσοστά λιπιδίων (σε %, κ.β. επί της ξηράς μυκηλιακής μάζας) αναφέρθηκαν στις πρώιμες φάσεις της αύξησης (μέγιστο ποσοστό λιπιδίων ~18%, κ.β.), με το ποσοστό λίπους να μειώνεται αξιοσημείωτα προϊούσης της ζύμωσης. Όπως και σε προηγούμενες αναλύσεις, παρατηρήθηκε μη-αμελητέα ύπαρξη χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) επί των παραγόμενων μυκηλιακών λιπιδίων. Πάντως, καίτοι οι διάφορες πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζουν μεγάλη βιοχημική ομοιότητα σε μεταβολικό επίπεδο, η αύξηση του V. volvacea AMRL 190 σε αυτού του είδους τα υποστρώματα έδειξε αξιοσημείωτες διαφοροποιήσεις στο επίπεδο της σύστασης σε λιπαρά οξέα των συνολικών λιπιδίων. Επίσης, ποσοτικοποίηση των λιπιδιακών κλασμάτων έδειξε (σχετικά) υψηλή περιεκτικότητα των NL (47-65% κ.β. επί των συνολικών λιπιδίων), ενώ σε μικρότερα ποσά ανιχνεύτηκαν τα G+S και (κυρίως) τα PL. Ανάλυση της σύστασης των φωσφολιπιδίων έδειξε διαφοροποιήσεις σχετιζόμενες με τις πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ τα κύρια PL που ανιχνεύτηκαν ήταν οι κλάσεις φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (PE), φωσφατιδυλινοσιτόλη (PI), φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και φωσφατιδυλοχολίνη (PS). Τέλος, ο μύκητας V. volvacea 190 καλλιεργήθηκε υπό αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις γλυκόζης (30 έως 95 g/l) και σταθερή αρχική συγκέντρωση αζώτου. Στα πρώιμα στάδια των ζυμώσεων, η αύξηση του αρχικού λόγου C/N (από 20 έως 60) είχε ως απόρροια αξιοσημείωτη αύξηση του ποσοστού των παραγόμενων ενδοκυτταρικών λιπιδίων (από ~14% σε ~31% κ.β. επί ξηράς μάζας), ενώ αυξήθηκε και η μέγιστη συγκέντρωση μυκηλιακής μάζας (μέγιστη τιμή βιομάζας ~22 g/l για αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 95 g/l). Παρόλα αυτά, ο συντελεστής YX/Glc μειώθηκε αξιοσημείωτα με την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκόζης, ενώ η ταχύτητα κατανάλωσης της γλυκόζης rGlc (σε g/l/d) αυξήθηκε σημαντικά. Ο αυξανόμενος περιορισμός του μέσου σε άζωτο είχε ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση IPS σε πολύ μεγάλες και διαρκώς αυξανόμενες ποσότητες. Η μέγιστη συγκέντρωση IPS ανιχνεύτηκε για αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 95 g/l και ήταν 12,2 g/l, τιμή συγκρινόμενη με τις υψηλότερες της διεθνούς βιβλιογραφίας. Κινητική ανάλυση της βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικών λιπιδίων και πολυσακχαριτών έδειξε μια αλληλοδιαδοχή στη συσσώρευση των ενδοκυτταρικών προϊόντων, καθώς αρχικά συντέθηκαν σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις λιπίδια και κατόπιν παρατηρήθηκε αύξηση της συσσώρευσης των IPS με ταυτόχρονη αποικοδόμηση των λιπιδίων. Στα υποστρώματα που εμφάνιζαν υψηλούς λόγους C/N υπήρχε σύνθεση λιπιδίων πλούσιων σε λινελαϊκό οξύ, ενώ η παρουσία των χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) μειωνόταν πολύ. Το κλάσμα των PL ήταν εκ νέου το πιο κορεσμένο, ενώ ανιχνεύτηκαν κυρίως οι κλάσεις PE, PI, PC και PS, το ποσοστό των οποίων μεταβάλλονταν με το λόγο C/N και το χρόνο της ζύμωσης. Τέλος, η σύσταση των παραγομένων IPS σε απλά σάκχαρα μεταβαλλόταν σε συνάρτηση με το χρόνο καλλιέργειας, με τη γλυκόζη να είναι η κύρια δομική μονάδα των ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών