Establishing a tissue culture of human PDL-fibroblasts from donors with active periodontitis

Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Etablierung einer Zellkultur aus parodontal erkrankten PDL-Zellen unter Entwicklung einer spezifischen Antibiose zur Kultivierung und einer sich daran anschließenden vergleichenden Charakterisierung der Genexpressionsmuster von gesunden und erkrankten PDL-Zellen. Die Analyse wird unter Verwendung der Methoden des FACS und der real-time (RT)-PCR durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen in der real-time (RT)-PCR eine Herunterregulation von Kollagen Typ I und Runx2 im Vergleich zu gesunden PDL-Zellen. Eine unveränderte Expression stellt sich für CD13 und CD73 als Faktoren, welche die Immunantwort modulieren, und für CD44 und CD29 als Adhäsionsmoleküle dar. Die statistische Auswertung der FACS-Ergebnisse ergibt, dass zwischen gesunden und parodontal erkrankten PDL-Zellen für Kollagen Typ I und CD73 signifikante Unterschiede in der Expression bestehen; die Expression ist jeweils im erkrankten Gewebe niedriger. Im Rahmen der Charakte! risierungsstudien von erkrankten im Vergleich zu gesunden PDL-Zellen konnten sich einige Unterschiede in den jeweiligen Expressionsmustern darstellen lassen, jedoch nicht so deutlich wie in vorangegangenen ex-vivo-Microarray-Studien unserer Arbeitsgruppe. Hierfür könnte die Angleichung der primär erkrankten PDL-Zellen aufgrund des in Kultur fehlenden inflammatorischen Reizes verantwortlich sein. Demnach tragen die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse bei zu der Entwicklung einer detaillierten Simulation der chronischen Parodontitis in vitro, z.B. in Form eines Zwei-Kammer-Modells (mit paralleler Bakterien-/Zellen-Kultur unter Aufrechterhaltung entzündungsähnlicher Konditionen). Die Ergebnisse aus dem FACS und der real-time (RT)-PCR verbessern das Verständnis der pathophysiologischen Vorgänge der chronischen Parodontitis und stellen eine weitere Grundlage für die nachfolgende Entwicklung von Therapieansätzen und die Erweiterung des klinischen Therap! iespektrums dar.We compared healthy PDL-fibroblasts with inflamed PDL-fibroblasts from healthy donors and such with active periodontitis in vitro. We showed expression profiles of the cells at the m-RNA and the protein level. Healthy periodontal tissues werde obtained from extracted teeth from donors without periodontal lesions (mostly extracted for orthodontic reasons). Inflamed cells were obtained from extracted teeth with periodontal disease. Initially we had to work out a special antibiotics combination to be able to culture the inflamed and contaminated PDL-cells. For cultivation of healthy PDL-fibroblasts an established antibiotics protocol (penicillin, streptomycin) was used. For the inflamed PDL-fibroblasts a combination of amoxicillin, metronidazole and amphotericin b was applied. Both groups of PDL-fibroblasts werde characterized by fluorescence-activated-cell-sorting (FACS) and by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) applying immunomodulatoring (CD13, CD73, Runx2) and ex! tracellular matrix component (CD29, CD44, collagen type I) markers. In both, healthy and inflamed PDL-fibroblasts, high rates of CD13- and CD29-positive cells and minimal rates of CD44-positive cells were detected. Significant differences were determined for the levels of Runx2 and collagen type I, which decreased in inflamed fibroblasts. The analysis by RT-PCR showed no differences for expression levels between healthy and inflamed PDL-cells regarding to CD13, CD29, CD44 and CD73. Expression levels of Runx2 and collagen type I were decreased in inflamed PDL-fibroblasts. In inflamed PDL-fibroblasts decreased m-RNA levels of collagen type I correlate with tissue degradation in periodontitis. The other markers, which seemed to be involved in inflammation, can be subjects of further investigation to make progress in understanding the pathophysiological process in periodontitis