Vergleich der Immunantwort humaner Parodontaler Ligamentzellen auf verschiedenen TLR2 Agonisten in An- und Abwesenheit von CD14

Einführung: Die Parodontitis beschreibt eine multifaktorielle infektiöse Erkrankung des Zahnhalteapparats. Parodontale Ligamentzellen (PDL-Zellen) spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und der Progression der Parodontitis. CD14 ist ein Oberflächenmolekül, das vor allem von Makrophagen und Monozyten exprimiert wird. Es wurde bewiesen, dass CD14 in löslicher Form (soluble CD14, sCD14) die Reaktion der humanen PDL-Zellen auf den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4)-Agonisten Lipopolysacharid (LPS) steigert. Ebenso wiesen einige Studien nach, dass die Antwort auf TLR2-Agonisten in Makrophagen in Anwesenheit von sCD14 erhöht wird. Unerforscht ist bislang der Einfluss von sCD14 auf TLR2-Agonisten in PDL-Zellen. Daher untersuchten wir in vorliegender Arbeit die Effektivität der Anwesenheit von sCD14 in Reaktion der PDL-Zellen auf TLR2-Agonisten. Als TLR2-Agonisten wurden das Lymphotoxin alpha (LTA) sowie der Fibroblasten-stimulierende Faktor 1 (FSL1) gewählt. Zielsetzung: In dieser Diplomarbeit wurde mithilfe von in vitro Versuchen getestet, ob CD14 in löslicher Form die Antwort von PDL-Zellen auf die TLR2-Agonisten LTA und FSL1 beeinflusst. Methodik: Nach der Kultivierung gesunder primärer humaner PDL-Zellen von fünf verschiedenen Donoren wurde ein Teil dieser Zellen mit den TLR2-Agonisten LTA (11000 ng/ml) sowie FSL1 (0,1100 ng/ml) in Anwesenheit von sCD14 (250 ng/ml) stimuliert. Die Gruppen ohne sCD14 wurden zur Schaffung einer Vergleichsmöglichkeit betrachtet. Danach wurde die Genexpression der Interleukine (IL) IL-6, IL-8 und MCP-1 durch Echtzeit-PCR-Versuche analysiert. Anschließend erfolgte die Messung des Proteinlevels von IL-6, IL-8 und MCP-1 in den Zellkultur-Überständen mittels ELISA. Schließlich wurde die statistische Analyse mit dem Statistikprogramm SPSS (IBM, Armonk, USA), Version 24.0, durchgeführt. Resultat: Nach Beurteilung der Ergebnisse wurde festgestellt, dass TLR2-Agonisten in Abwesenheit von sCD14 dosisabhängig einen signifikanten Anstieg der Genexpression von IL-6-, IL-8- und MCP-1 induzieren. Unsere Daten zeigten ebenso, dass in Gegenwart von sCD14 die Antwort von PDL-Zellen auf beide untersuchten TLR2-Agonisten in niedriger und submaximaler Konzentration signifikant erhöht wird. Dies lässt auf eine konzentrationsabhängige Steigerung der Genexpression von IL-6, IL-8 und MCP-1 schließen. Die lösliche Form von CD14 ermöglichte es, dass PDL-Zellen verschiedene TLR2-Agonisten in äußerst niedrigen Konzentrationen, ab 0,1 ng/ml bei FSL1 und ab 1 ng/ml bei LTA erkennen. Konklusion: Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass sCD14 die Reaktion der PDL-Zellen auf TLR2-Agonisten besonders in submaximalen Konzentrationen (dosisabhängig) steigert. Diese Studie weist zum ersten Mal ebenso auf, dass sCD14 eine wesentliche Rolle, nicht nur in verschiedenen Immunzellen wie Monozyten, sondern auch in mesenchymalen Stammzellen wie PDL-Zellen, spielt. Anschließend kann die Anwesenheit von sCD14 die immunmodulatorische Aktivität von PDL-Zellen verändern, was die Entwicklung einer Parodontitis beeinflussen kann.Introduction: Periodontitis is an inflammatory disease affecting the tissues surrounding the teeth (periodontium) that is caused by the hosts inflammatory response to plaque biofilm. Human periodontal ligament cells (PDLs) can be activated by different periodontal pathogens and play an important role in periodontitis progression. These cells do not express membrane CD14, which plays the important role of lipopolysaccharide (LPS) signaling through toll-like receptor 4 (TLR-4). Several studies also show that soluble CD14 (sCD14) enhances the responsiveness of different immune cells to TLR-2, but so far there no research has been conducted about such an effect in PDLs. Therefore, in the present study, we investigated the effect of sCD14 on the response of PDLs to two different TLR2-agonists, LTA and FSL1, in vitro. Aim: The aim of this diploma thesis is to examine if sCD14 influences the response of human PDLs to TLR2-agonists and the immune response of periodontal ligament cells using an in vitro study. Materials and methods: Human PDLs were cultivated from five different donors and stimulated with different concentrations of LTA (1 -1000 ng) and FSL1 (0.1-100 ng) with or without sCD14 (250 ng/ml). All stimulations were performed in FBS-free DMEM and supplemented with 1% P/S. After 24 hours, the mRNA expression levels of IL-6, IL-8, and MCP-1 were determined by quantitative polymerase chain reaction qPCR. While the cells protein production was measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Finally, the statistical analysis was performed using SPSS (IBM, Armonk, USA) Statistics Program, Version 24.0. Result: TLR-2 agonists induced a significant increase in the expression of IL-6, IL-8 and MCP-1 protein levels in a dose-dependent manner, albeit in the absence of sCD14. Our data showed that in the presence of sCD14 (250 ng/ml), the response of PDLs to both types of TLR-2 agonists was significantly increased. We found that the presence of sCD14 enabled PDLs to recognize different TLR-2 agonists even at very low concentrations, starting at 0.1 ng / ml for FSL1 and 1 ng / ml for LTA. Conclusion: Our data demonstrate that exogenous sCD14 substantially enhances the production of inflammatory mediators by PDLs in response to stimulation even with small amounts of TLR-2 agonists. Local levels of sCD14 could be an important factor for modulation of the host response, especially in PDLs opposing different periodontal pathogens as well as in the progression of periodontitis and the control of the inflammatory response by PDLs. This study also shows for the first time that sCD14 plays an important role not only in immune cells, such as monocytes, but also in mesenchymal stem cells, such as PDLs.Paralleltitel laut Übersetzung des VerfassersMedizinische Universität Wien, Diplomarbeit, 2019(VLID)447111